这篇研究由Juanjuan Wang、Yi Shi、Yunhuan Gao、Ningning Zhu、Yuqing Liu、Yuan Zhang、Chen Xu及通讯作者Rongcun Yang共同完成，作者们主要来自南开大学免疫学系以及天津医科大学总医院等机构。该原创性研究发表于2026年的《Journal for Immunotherapy of Cancer》期刊上。

该研究旨在深入探究肿瘤免疫学领域一个关键难题：如何将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，以提升免疫治疗效果。在癌症治疗中，免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors， ICIs）对“热肿瘤”（富含CD8+ T细胞）有效，但对“冷肿瘤”（缺乏CD8+ T细胞）则效果不佳。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）是塑造肿瘤免疫抑制微环境的核心角色。其中，高表达分泌型磷蛋白1（Secreted phosphoprotein 1, SPP1/骨桥蛋白）的SPP1+ TAMs亚群在多种癌症中被发现与CD8+ T细胞浸润减少和患者不良预后相关。然而，SPP1+ TAMs直接排斥CD8+ T细胞的因果证据及其背后确切的分子机制尚不明确。本研究的目标，正是阐明巨噬细胞来源的SPP1如何调控CD8+ T细胞向肿瘤微环境（Tumor Microenvironment， TME）的招募，并探索靶向SPP1作为增强免疫治疗新策略的潜力。

本研究的实验流程设计严谨且系统，整合了临床样本分析、多肿瘤小鼠模型、单细胞测序以及深入的分子机制探索。研究主要包含以下几个关键环节：

首先，研究者利用公开数据库和临床样本验证了临床相关性。他们分析了结肠腺癌（COAD）和直肠腺癌（READ）的公共数据，发现SPP1高表达与患者生存率低、巨噬细胞浸润高呈正相关，而与CD8+ T细胞浸润呈负相关。接着，他们收集了40例未经治疗的结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）患者的组织样本，通过免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）染色证实，SPP1+ TAMs比例高的肿瘤中，CD8+ T细胞的浸润显著减少。这为后续的功能研究提供了坚实的临床背景。

其次，为了在功能层面验证其因果性，研究者构建了巨噬细胞特异性敲除SPP1的小鼠模型（SPP1fl/fl-Lyz2-Cre，简称SPP1cKO）。他们向野生型对照（SPP1fl/fl）和SPP1cKO小鼠皮下注射了MC38（结直肠癌细胞）、B16-OVA（黑色素瘤细胞）和LLC（Lewis肺癌细胞）三种肿瘤细胞。结果显示，在三种模型中，SPP1cKO小鼠的肿瘤生长均受到显著抑制，肿瘤重量和体积都更小。通过流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞发现，SPP1cKO小鼠肿瘤中CD8+ T细胞的数量和比例显著增加，而髓源性抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells， MDSCs）、巨噬细胞和调节性T细胞（Regulatory T cells， Tregs）则减少。此外，通过将野生型或SPP1敲除的骨髓源性巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages, BMDMs）与MC38细胞共接种到野生型小鼠体内，进一步证实了巨噬细胞自身的SPP1缺失足以抑制肿瘤生长并促进CD8+ T细胞浸润。

第三，为了深入表征这些增多的CD8+ T细胞的功能状态，研究者对MC38肿瘤中的免疫细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。分析结果显示，与对照组相比，SPP1cKO小鼠肿瘤中CD8+ T细胞比例显著升高。更重要的是，这些细胞表现出更高的细胞毒性评分和增殖评分，以及更低的耗竭评分。基因表达分析显示，细胞毒性效应分子（如GZMB， IFNG）上调，而耗竭相关标志物（如PDCD1， TOX）下调。通过流式细胞术和定量PCR（qPCR）在蛋白和mRNA水平验证了这些发现，确认SPP1cKO肿瘤中的CD8+ T细胞具有更强的效应功能和更少的耗竭特征。此外，体内CD8 T细胞清除实验证明，使用抗CD8抗体清除CD8+ T细胞后，SPP1缺失带来的抑瘤效应完全消失，这确证了其抗肿瘤作用依赖于CD8+ T细胞。

第四，研究聚焦于探索SPP1缺失促进CD8+ T细胞招募的机制。通过分析scRNA-seq数据中的细胞间通讯，研究者发现SPP1cKO小鼠的巨噬细胞与CD8+ T细胞之间，CXCL9-CXCR3和CXCL10-CXCR3配体-受体对的相互作用信号显著增强。免疫荧光染色显示，SPP1cKO肿瘤组织中表达CXCR3的CD8+ T细胞以及表达CXCL9/10的巨噬细胞均更多。体外Transwell迁移实验表明，SPP1敲除巨噬细胞的条件培养基能更有效地吸引CD8+ T细胞迁移，而这种效应可被CXCR3抑制剂（AMG487）或CXCL9/10中和抗体所阻断。在体内，使用CXCR3抑制剂同样消除了SPP1缺失带来的抗肿瘤效果和CD8+ T细胞浸润增加。这些数据表明，SPP1缺失通过上调CXCL9/10-CXCR3轴来招募CD8+ T细胞。

第五，研究进一步深入，探寻SPP1如何调控CXCL9/10的表达。对SPP1cKO和对照巨噬细胞的RNA-seq分析显示，CXCL9、CXCL10以及转录因子STAT1在敲除细胞中表达上调。蛋白免疫印迹（Western blot）证实，SPP1cKO的巨噬细胞中STAT1的磷酸化水平（p-STAT1）显著升高。已知STAT1是驱动CXCL9/10表达的关键转录因子。当使用siRNA敲低巨噬细胞中的STAT1后，SPP1缺失导致的CXCL9/10上调被消除，CD8+ T细胞的迁移促进作用也随之消失。体内实验也证明，输注STAT1或CXCL9/10被敲低的SPP1缺失巨噬细胞，其抑制肿瘤生长和促进CD8 T细胞浸润的能力被削弱。

第六，研究探索了SPP1缺失导致STAT1激活的上游信号通路。基因集富集分析（GSEA）提示，SPP1cKO巨噬细胞中胞质DNA感知通路显著富集。该通路的核心是cGAS-STING信号轴。实验证实，SPP1cKO巨噬细胞中，cGAS-STING通路的关键成分磷酸化TBK1（p-TBK1）和磷酸化STING（p-STING）水平升高。同时，通过免疫荧光和超分辨率显微镜观察到，SPP1cKO巨噬细胞的细胞质中积累了更多的双链DNA（dsDNA）片段。这些胞质dsDNA是cGAS-STING通路的经典激活剂。

第七，为了追溯胞质dsDNA的来源，研究者检测了线粒体活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）。结果发现，SPP1cKO巨噬细胞的线粒体ROS水平显著升高。已知线粒体ROS可导致DNA损伤并产生DNA片段。当使用线粒体靶向抗氧化剂Mito-Tempo处理时，SPP1cKO巨噬细胞中升高的ROS水平、胞质dsDNA积累、STING磷酸化以及随后的STAT1激活和CXCL10表达均被逆转。相反，使用STING通路激动剂c-di-AMP则可增强这些效应。此外，研究还发现SPP1可能通过与CD44受体结合来发挥其抑制功能，因为阻断CD44可以逆转SPP1对ROS生成、STING/STAT1磷酸化及CD8+ T细胞迁移的抑制作用。

最后，研究者评估了靶向巨噬细胞SPP1与现有免疫疗法的协同潜力。在MC38肿瘤模型中，与单独使用抗PD-1抗体相比，SPP1cKO小鼠联合抗PD-1治疗展示了更强大的肿瘤抑制效果。这种协同效应伴随着肿瘤内CD8+ T细胞浸润的进一步增加，以及这些细胞效应功能（IFN-γ， GZMB）的增强和PD-1表达的降低。重要的是，这种联合治疗的增强效果同样依赖于CXCR3，因为使用CXCR3抑制剂可以将其抵消。

本研究的结论是：巨噬细胞来源的SPP1通过抑制ROS-胞质DNA片段/cGAS-STING/STAT1信号轴，下调关键趋化因子CXCL9和CXCL10的表达，从而阻碍CD8+ T细胞向肿瘤微环境的招募，促进肿瘤进展并削弱免疫检查点抑制剂疗法的效果。相反，在TAMs中敲除或抑制SPP1，可以激活上述信号通路，上调CXCL9/10，有效招募具有强细胞毒性的CD8+ T细胞，将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，显著抑制肿瘤生长并与现有免疫疗法产生协同效应。

这项研究的科学价值和应用价值十分突出。在科学上，它首次系统地阐明了SPP1+ TAMs排斥CD8+ T细胞的一条完整信号通路：从SPP1/CD44相互作用，到调控线粒体ROS和胞质DNA稳态，进而激活先天免疫感应器cGAS-STING和下游转录因子STAT1，最终影响趋化因子表达的级联反应。这为理解肿瘤免疫微环境中髓系细胞与T细胞的交互对话提供了全新的分子视角。在应用上，该研究确立了巨噬细胞SPP1作为一个极具潜力的新型治疗靶点。它提示，开发针对SPP1（例如使用小分子抑制剂、单克隆抗体或基于siRNA的策略）的药物，可能与现有的PD-1/PD-L1等免疫检查点抑制剂联合使用，为克服免疫治疗耐药性、扩大受益患者群体提供一种有效的“促浸润”联合策略。

本研究的亮点在于：首先，机制阐释的深度与完整性：研究从临床现象出发，利用基因工程小鼠模型、多组学技术和分子生物学手段，层层递进地揭示了一条从细胞表面受体到转录调控的完整信号轴，逻辑严谨，证据链坚实。其次，研究模型的系统性：研究不仅使用了MC38结直肠癌模型，还在B16-OVA和LLC模型中验证了核心发现，证明了该机制在不同肿瘤类型中的普适性。同时，结合了临床样本分析、体内动物模型、体外细胞实验以及生物信息学分析，构成了一个立体而全面的研究体系。第三，转化医学意义的明确性：研究直接探讨了靶向SPP1与临床常用免疫疗法（抗PD-1）的协同作用，并通过体内药理学干预（CXCR3抑制剂）明确了其效应依赖于特定的趋化因子轴，为未来的药物开发和临床试验设计提供了清晰的预临床依据。最后，对“冷热肿瘤”转化这一前沿问题的直接贡献：研究直接针对如何增加T细胞浸润这一免疫治疗核心挑战，提出了通过调控巨噬细胞功能来重塑肿瘤免疫微环境的具体可行路径，具有重要的理论和实践指导意义。