发表信息与主要作者
本项开创性研究由四川大学华西医院的石虎兵教授和马学磊教授领衔，刘晓伟、宋金恩、张浩等人作为共同第一作者完成。研究成果于2023年2月13日发表于国际顶级学术期刊 Cancer Cell（《癌细胞》杂志）。
研究背景与科学问题
肿瘤转移是导致癌症患者死亡的主要原因。循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）被视为肿瘤远处转移的“种子”，它们从原发性肿瘤脱落，进入血液循环，最终在远端器官“播种”形成转移灶。长久以来，科学界对于CTCs如何在随血液循环播散的过程中逃避免疫系统的监视和清除知之甚少。免疫检查点阻断疗法（Immune Checkpoint Blockade, ICB）的革命性成功，如抗PD-1/PD-L1抗体等，主要聚焦于增强T细胞在原发性肿瘤或转移灶微环境中的杀伤功能。然而，对于肿瘤细胞在血液循环这一关键转移路径中的免疫逃逸机制，研究尚属空白。
胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDAC）是一种恶性程度极高且易发生肝转移的癌种，其转移途径主要通过肝门静脉（Hepatic Portal Vein, HPV）系统。因此，肝门静脉中的CTCs代表了肿瘤转移的中间状态。本研究旨在回答三个核心问题：第一，血液循环中的肿瘤细胞是否会受到免疫细胞的攻击？第二，哪种免疫细胞执行了免疫清除功能？第三，CTCs如何通过抑制性检查点分子对来逃脱这种免疫监视？通过系统性地探究这些问题，研究者希望能找到阻断肿瘤血行转移的新策略。
详细研究工作流程
该项研究通过精密的实验设计，从临床样本出发，结合单细胞测序、功能实验和体内动物模型验证，层层递进地揭示了上述科学问题，其主要工作流程可分为四个阶段。
第一阶段：多维度单细胞转录组图谱的构建 为系统描绘PDAC转移过程中的细胞生态系统，研究团队收集了6名未经治疗的PDAC伴肝转移患者的活检样本，包括原发性肿瘤组织、肝转移肿瘤组织以及通过腹腔镜采集的肝门静脉血液。他们通过微流控平台，利用EpCAM/CA19-9捕获探针从血液中分离出高纯度的CTCs。随后，利用10x Genomics平台对这三类来源的细胞进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）。经过严格质控，总共获得了74,206个高质量的单细胞转录组数据，其中包含27,296个原发肿瘤细胞、36,922个肝转移肿瘤细胞和9,988个来自肝门静脉血的细胞。通过对这些数据进行t-SNE可视化和细胞亚群定义，研究者构建了一个涵盖原发灶、循环系统和转移灶的全景式细胞图谱。
第二阶段：细胞间相互作用分析与关键免疫检查点的发现 为了明确免疫监视的动态变化，研究者对所有CD45阳性的免疫细胞进行了亚群细分，鉴定出NK细胞、CD8效应T细胞、调节性T细胞等多种淋巴系和髓系细胞。接着，利用CellPhoneDB算法系统计算了肿瘤细胞与各类免疫细胞之间的配体-受体分子对相互作用。分析结果呈现出鲜明的区室化特征：在原发灶和转移灶中，肿瘤细胞与耗竭T细胞等存在复杂的多重免疫检查点互作（如LGALS9-HAVCR2, TIGIT-Nectin2/3等）；然而在血液循环中，CTCs与免疫细胞的相互作用模式极为独特且相对简单，其中占绝对主导地位的是CTCs与自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞之间的相互作用。通过深入剖析免疫检查点相关分子对，研究团队发现CTCs与NK细胞之间最强烈的抑制性信号来自HLA-E及其受体CD94-NKG2A。进一步分析显示，编码HLA-E的mRNA水平在CTCs上显著高于其在实体瘤细胞中的水平，而受体NKG2A则在肝门静脉血的NK细胞上高表达。多重免疫荧光染色和细胞粘附实验也直接观察到CTCs与NK细胞在血液中形成细胞簇，证实了它们之间存在直接接触。
第三阶段：体内外功能实验验证免疫检查点的作用 为验证HLA-E:CD94-NKG2A作为功能性免疫检查点的假设，研究者开展了一系列体内外实验。在体外，通过NK细胞毒性实验发现，在PDAC细胞系上过表达HLA-E能够显著保护肿瘤细胞免受患者来源NK细胞的杀伤；而使用NKG2A阻断抗体（Monalizumab）或敲低肿瘤细胞的HLA-E表达，均能有效恢复NK细胞的杀伤活性。在关键的体内实验环节，研究者通过尾静脉注射荧光素酶标记的小鼠PDAC细胞（KPC）构建了模拟CTC介导肺部转移的模型。结果显示，在接种肿瘤细胞前一天（第-1天）即开始预防性使用NKG2A阻断抗体，能够极其显著地抑制肺部转移的形成；而若在接种后第3天或第5天才开始治疗，则几乎无法阻止转移。这一时间窗口效应强烈表明，该免疫检查点的阻断效用仅限于杀死血液循环中的肿瘤细胞，而对已定植在组织中的肿瘤细胞无效。同样，在接种前预先敲低KPC细胞上的人类HLA-E同源蛋白H2-T23，也得到了几乎完全一致的抑制转移效果。以上结果在免疫健全的C57BL/6小鼠模型中得到了双重验证。此外，在皮下移植瘤模型中，无论是NKG2A阻断还是H2-T23敲低均不能抑制肿瘤生长，这排除了该免疫检查点影响原位肿瘤生长的可能性，精确定义了其作用范围即在血循环中。
第四阶段：CTCs上调HLA-E的分子机制探究 为了解决CTCs如何上调HLA-E这一关键问题，研究者分析了scRNA-seq数据，寻找与HLA-E表达正相关的基因，最终将目光锁定在RGS18上。RGS18是一个典型的血小板来源基因。免疫荧光和数据分析显示，RGS18几乎只在CTCs中特异性高表达，而不在实体瘤细胞中表达。功能实验表明，在多个PDAC细胞系中过表达RGS18，能最有效地提升HLA-E的蛋白水平。机制上，RGS18通过抑制GPCR下游的AKT信号通路，导致AKT磷酸化水平降低，进而减少了其对下游GSK3β激酶的抑制性磷酸化（Ser9位点）。稳定的GSK3β进一步磷酸化并激活转录因子CREB1，促使其进入细胞核，结合到HLA-E基因启动子的SXY模块上，最终上调HLA-E的表达。这一完整的AKT-GSK3β-CREB1信号轴得到了基因过表达、敲低以及组成型激活突变体（AKT E17K/Q79K）实验的严整验证。更重要的是，研究者发现CTCs并非自身大量表达RGS18，而是通过内吞并摄取血小板来获得外源性的RGS18 mRNA。共聚焦显微镜和流式细胞术实验清晰地捕捉到了PDAC患者来源的血小板被肿瘤细胞内吞的现象，并且只有患者来源的血小板能显著上调肿瘤细胞的RGS18和HLA-E水平。在模拟肝转移的脾内注射模型中，过表达RGS18的肿瘤细胞展现出更强的肝转移能力，而这一促转移作用依赖于NK细胞的存在，并且可以通过敲低HLA-E来逆转，从而完整地将“血小板-RGS18-HLAE”这条免疫逃逸轴连接起来。
研究结论与价值
本研究首次揭示了一个在血液循环中介导CTCs免疫逃逸的关键机制：CTCs通过内吞血小板获得RGS18，后者通过AKT-GSK3β-CREB1信号通路上调免疫检查点分子HLA-E的表达。高表达的HLA-E与NK细胞表面的抑制性受体CD94-NKG2A结合，从而抑制NK细胞的细胞毒性，保护CTCs免受免疫清除。通过抗体阻断或基因干预来中断HLA-E:CD94-NKG2A的相互作用，能够有效恢复NK细胞的免疫监视功能，特异性地清除血液循环中的CTCs，进而阻止肿瘤的血行转移。
该研究的科学价值在于，它将肿瘤免疫监视的研究范畴从传统的组织微环境拓展到了血液循环这一至关重要的播散阶段，阐明了血小板不仅仅是CTCs的物理“盾牌”，更通过提供生物活性分子（如RGS18）主动帮助其建立免疫逃逸能力。其应用价值体现在为预防肿瘤转移提供了新的治疗靶点和精准的干预窗口期，尤其对于手术切除肿瘤等可能导致CTCs大量释放入血的临床场景，靶向HLA-E:CD94-NKG2A的辅助治疗具有巨大的应用潜力。
研究亮点与创新之处
此项研究的亮点突出。首先，其发现具有首创性，首次明确了CTCs在血液循环中逃避NK细胞免疫监视的特异性免疫检查点分子HLA-E:CD94-NKG2A。其次，研究视角独特，系统对比了原发灶、循环系统和转移灶三个不同解剖部位的肿瘤-免疫互作模式，揭示了免疫监视在空间上的动态差异性。再者，机制阐述新颖，发现了“CTCs内吞血小板获取RGS18”这一全新的分子传递机制，为理解血小板促转移功能提供了超越传统凝血和物理屏障的新见解。最后，实验论证周密，通过在多种动物模型中设计精细的时间窗阻断实验和“救赎”实验，无可辩驳地证明了该免疫检查点在循环系统的关键作用及其精准的干预时机，为未来临床转化奠定了坚实的理论基础。