学术报告

一、研究作者、机构及发表信息

本文作者包括 Salman M. Toor，Khaled Murshed，Mahmood Al-Dhaheri，Mahwish Khawar，Mohamed Abu Nada 和 Eyad Elkord，研究团队来自于多个机构，包括卡塔尔的 Qatar Biomedical Research Institute (QBRI)，Hamad Medical Corporation，以及英国的 University of Salford。该研究成果发表于《Frontiers in Immunology》期刊，发表时间为 2019 年 12 月 17 日，文章标题为“Immune Checkpoints in Circulating and Tumor-Infiltrating CD4+ T Cell Subsets in Colorectal Cancer Patients”。

二、研究背景

本研究聚焦肿瘤免疫微环境（Tumor Immune Microenvironment, TIME）对结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）患者治疗反应和疾病进展的影响。CRC 是全球范围内癌症相关死亡和发病的主要原因之一，每年有超过 140 万例新发病例，导致 70 万人死亡。现有疗法包括手术、放疗、化疗等，但免疫治疗，如免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）的应用在 CRC 中疗效有限。原因可能在于肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中免疫调节机制对治疗响应的抑制作用。因此，更全面了解 CRC 中 CD4+ T 细胞亚群及其相关免疫检查点的表达情况，对开发新的标志物和靶向治疗策略具有重要意义。

本研究旨在对 CRC 患者中循环及肿瘤浸润 CD4+ T 细胞亚群的表型和关键免疫检查点及调节性 T 细胞（Treg）相关标志物进行表征。同时，研究团队还考察这些标志物的表达与病理特征（如疾病分期和肿瘤芽生）的相关性，以探索其潜在临床应用价值。

三、研究流程及方法

1. 样本采集与处理

   • 研究团队从未经治疗的 34 名 CRC 患者中采集外周血样本，从其中 27 名患者处取得肿瘤组织（TT）及相邻的非癌组织（NT）。所有患者均提供书面知情同意，研究获得了伦理批准。
     
   • 外周血样本中的外周血单核细胞（PBMC）通过密度梯度离心法分离，并冷冻存储。NT 和 TT 样本通过机械方法解离为单细胞悬液。

2. 多参数流式细胞术

   • 样本中的细胞被标记多种抗体，包括靶向 CD4、CD25、PD-1（程序性死亡蛋白-1）、CTLA-4（细胞毒性 T 淋巴细胞抗原-4）、TIM-3（T 细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白-3）、LAG-3（淋巴细胞激活基因-3）和 Helios 等的抗体。随后使用流式细胞仪（BD LSR Fortessa X-20 SORP）进行数据采集，FlowJo 软件分析数据。
     

3. 统计分析

   • 数据使用 GraphPad Prism 8 软件进行统计学处理，通过单因素方差分析（One-way ANOVA）及配对 t 检验计算样本组间差异的显著性。

四、研究主要结果

1. CD4+ T 细胞增加及亚群分布

   • 相较于正常组织和外周血，结直肠肿瘤微环境中 CD4+ T 细胞显著增加（TME 为 22.0%，NT 为 11.5%，PBMC 为 31.4%）。这些 CD4+ T 细胞主要由具有免疫抑制功能的 Tregs 组成。
     
   • Tregs 中，CD4+FoxP3+Helios+ 亚群显著富集在 TME 中（PBMC: 5.7%, NT: 6.6%, TME: 20.5%）。

2. 免疫检查点和标志物表达

   • CD4+ T 细胞在 TME 中普遍上调了 PD-1、CTLA-4、TIM-3 和 LAG-3 的表达水平, 且 CTLA-4 和 TIM-3 的表达水平在 Tregs 中显著高于其他亚群。
     
   • FoxP3high Tregs 在 TME 中表达更高水平的 Helios，同时表现出增强的免疫抑制特性，这些细胞还显著共表达 CTLA-4 和 TIM-3。

3. 疾病分期和肿瘤芽生的相关性

   • CRC 晚期患者（III-IV 期）外周血中循环的 CD4+CTLA-4+ T 细胞水平高于早期患者（I-II 期）。然而，肿瘤芽生状态与 CD4+ T 细胞亚群的分布未表现出显著相关性。

五、研究结论及意义

该研究详细揭示了 CRC 患者循环及肿瘤浸润 CD4+ T 细胞的免疫检查点表达和调节性 T 细胞的分布特点。研究发现 Tregs，尤其是 FoxP3highHelios+ 亚群，在 TME 中的富集可能通过增强免疫抑制作用阻碍免疫检查点阻滞（ICB）疗法的效果。除此之外，高水平免疫检查点的表达与晚期疾病分期相关，为进一步开展个性化治疗提供了可能的标志物与靶点。

研究结果强调免疫调节细胞在 CRC 中的关键作用，并支持通过抑制 Tregs 或联合靶向策略以改进当前免疫治疗方案的必要性。

六、研究亮点

1. 该研究同时比较了 CRC 患者的循环、正常组织及肿瘤微环境中 CD4+ T 细胞亚群及其免疫检查点表达的差异。
2. 突出了 FoxP3highHelios+ Tregs 在肿瘤微环境中的关键作用，并揭示了其高水平免疫检查点表达。
3. 阐明循环 CD4+CTLA-4+ T 细胞在晚期患者中的上调，为临床标志物探索提供了新方向。
4. 提供了 PD-1 和 TIM-3 等潜在靶点的全面分析信息，为未来多靶点组合疗法设计提供理论支持。

七、研究的潜在应用

1. 本研究的结果为 CRC 免疫治疗新靶点的开发提供了数据支持，尤其是在免疫检查点抑制剂效果有限的患者中。
   
2. 高水平的 FoxP3+Helios+Tregs 和免疫检查点表达可以作为 CRC 疾病进展和治疗响应的潜在生物标志物。
   
3. 研究数据还为不同治疗阶段的患者提供了免疫学特征参考，可用于个性化治疗策略的制定。