一项革新性研究：ITPAUMS——解析天然产物作用机制的新范式

一、 研究作者、机构与发表信息

本研究由来自浙江大学药学院的于恒源、陈阳（并列第一作者）、王奕辰、付伟亮、徐瑞、刘杰、陈勇、刘雪松以及吴勇江（通讯作者）和徐腾飞（通讯作者）共同完成。研究论文《Integrated Thermal Proteome Profiling and Affinity Ultrafiltration Mass Spectrometry (ITPAUMS): A Novel Paradigm for Elucidating the Mechanism of Action of Natural Products》于2024年9月10日在线发表于分析化学领域的权威期刊《Analytical Chemistry》（2024年，第96卷，第15980-15990页）。

二、 学术背景与研究目的

本研究隶属于药物发现与化学生物学交叉领域，特别是天然产物（Natural Products, NPs）作用机制（Mechanism of Action, MoA）的解析技术。天然产物是创新药物研发的重要源泉，大量已上市的小分子药物直接或间接来源于天然产物。然而，天然产物通常具有“多组分、多靶点、多层次”相互作用的复杂特性，这使得精确阐明其药效物质基础和作用靶点网络（即“靶点反卷积”，Target Deconvolution）成为一项长期且艰巨的挑战。

传统的化学蛋白质组学方法（如基于活性探针的蛋白质谱分析，Activity-Based Protein Profiling, ABPP）虽然强大，但通常需要对天然产物小分子进行化学修饰以引入报告基团，这一过程可能改变其生物活性或结合特异性，且对于结构复杂或含量低的成分，甚至对于天然产物提取物（Natural Product Extracts, NPEs）这样的混合物，该方法往往难以实施。因此，亟需开发无需标记、能够处理复杂混合物、并能建立精确“组分-靶点”对应关系的新方法。

本研究的核心目标是开发并验证一种创新的集成分析流程，以克服上述瓶颈。研究团队提出了名为“集成热蛋白质组谱分析与亲和超滤质谱”（ITPAUMS）的新策略。该策略旨在：1）利用无需标记的热蛋白质组谱分析（Thermal Proteome Profiling, TPP）技术，高通量地筛选出天然产物混合物作用的潜在靶点群；2）结合具有高特异性的亲和超滤质谱（Affinity Ultrafiltration Mass Spectrometry, AUMS）技术，从混合物中精确鉴定出与特定靶点结合的活性小分子成分，从而构建“一对一”的组分-靶点图谱。为了证明该流程的有效性，研究以大麻油提取物（Hemp Oil Extract, HOE）——一种已知具有抗结直肠癌活性但具体机制不明的多组分天然产物混合物——作为模型体系进行案例研究。

三、 详细研究流程

ITPAUMS研究流程是一个系统性、迭代式的分析过程，主要包含以下几个关键步骤：

第一步：应用TPP技术发现HOE的潜在靶点群 研究以人结直肠癌细胞SW620的裂解液作为研究对象，模拟细胞内环境。实验设计将裂解液分为两组：一组与HOE（40 μg/mL）共孵育，另一组与溶剂对照（DMSO）共孵育。每组样品再等分为7份，分别在不同温度（46°C至64°C，共7个温度点）下进行短暂加热。加热导致蛋白质发生热变性并沉淀，而与小分子配体结合的蛋白质通常会表现出更高的热稳定性，因此在相同温度下，结合了HOE成分的靶蛋白在溶液中的可溶部分会相对更多。加热后，通过离心去除变性沉淀的蛋白质，收集上清液中的可溶蛋白。对每个温度点的可溶蛋白样品进行胰蛋白酶酶解，产生的肽段使用串联质谱标签（Tandem Mass Tag, TMT）进行标记，然后将所有样品混合，进行高效液相色谱分级，最后通过超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）进行定量分析。通过比较HOE处理组与对照组在各个温度下数千种蛋白质的丰度变化，利用生物信息学分析（如计算折叠变化和P值，并按综合排序筛选），可以鉴定出那些热稳定性发生显著变化的蛋白质，这些蛋白被视为HOE作用的潜在靶点群。此步骤中，TPP技术本身作为无需标记、高通量的靶点筛选方法被应用，其数据处理依赖于专业的蛋白质组学软件（Proteome Discoverer, Mascot）和R语言进行统计分析。

第二步：验证关键靶点CDC123并确认其疾病相关性 从TPP筛选出的众多潜在靶点中，研究聚焦于热稳定性显著上调且排名靠前的蛋白CDC123（排名第二）。首先，通过温度依赖性细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）在细胞裂解液和完整细胞水平验证了HOE处理能确实提高CDC123蛋白的热稳定性。接着，利用表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术直接测定了HOE与重组CDC123蛋白的结合亲和力（KD = 3.74 μg/mL），从生物物理角度证实了相互作用。为了评估CDC123作为治疗靶点的潜力，研究进行了生物信息学分析和功能验证：利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库和单细胞测序数据库分析，发现CDC123在结直肠癌等多种肿瘤组织中显著高表达；通过小干扰RNA（siRNA）敲低CDC123的表达，证明其能显著抑制多种结直肠癌细胞的活力，表明CDC123是结直肠癌细胞增殖所必需的关键蛋白。这些结果共同确立了CDC123作为HOE抗结直肠癌作用的一个合理且重要的分子靶点。

第三步：应用AUMS技术筛选CDC123的配体成分 在确定了靶点CDC123后，下一步是从复杂的HOE混合物中找出与之特异性结合的活性成分。研究采用AUMS技术：将HOE与纯化的重组CDC123蛋白在生理缓冲液中共同孵育，形成配体-蛋白复合物。随后使用截留分子量为10 kDa的超滤离心管进行分离，未结合的小分子可以透过膜，而与CDC123结合的配体则随蛋白复合物被截留。经过洗涤去除非特异性吸附后，用甲醇对截留物进行超声处理，将配体从蛋白上解离下来。解离后的溶液经离心、浓缩后，进行超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）分析。作为对照，实验同时使用变性的CDC123蛋白进行相同操作。通过比较与活性蛋白和变性蛋白孵育后样品中各色谱峰（对应不同化合物）的离子丰度，计算结合率，从而筛选出与CDC123特异性结合的成分。此步骤中，AUMS作为从混合物中快速筛选特定靶点配体的关键技术被应用。

第四步：鉴定关键配体CBD并验证其与CDC123的相互作用 AUMS分析结果显示，HOE中有四个主要成分与CDC123结合，其中结合率最高的成分（峰2）通过对比保留时间、一级质谱和二级质谱图，被明确鉴定为大麻二酚（Cannabidiol, CBD）。为了深入理解CBD与CDC123的结合模式，研究进行了分子对接模拟，结果显示CBD可能结合在CDC123的活性口袋，与Glu177、Ser121和Leu122等氨基酸残基形成氢键相互作用。进一步的分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟（100 ns）表明，CBD-CDC123复合物结构稳定，均方根偏差波动小。结合自由能计算揭示了Glu177和Leu122是结合的关键贡献残基。最后，再次使用SPR实验定量验证了纯品CBD与CDC123蛋白的直接结合，测得其平衡解离常数KD为19.16 μM，证实了二者之间存在中等强度的特异性相互作用。至此，通过ITPAUMS流程，成功建立了从混合物（HOE）到靶点群（TPP发现），再到关键靶点（CDC123），最后到特异性活性成分（CBD）的清晰、直接的“一对一”对应关系（CBD-CDC123）。

第五步：验证CBD与HOE的抗癌活性一致性 为了确认CBD是否能部分代表HOE的治疗效果，研究比较了二者在体外对结直肠癌细胞的抗增殖活性。细胞活力实验（CCK-8法）显示，HOE和CBD均能剂量依赖性地抑制多种结直肠癌细胞系（HCT-116， SW620， SW480， HT-29）的活力，而对正常结肠上皮细胞（HCoEPiC）的毒性较低，表现出选择性。克隆形成实验进一步证实了二者对SW620细胞增殖的抑制能力。更重要的是，蛋白质印迹（Western Blot）分析表明，用HOE或CBD处理SW620细胞24小时后，细胞内CDC123的蛋白水平均下降。这提示，无论是HOE混合物还是其关键成分CBD，都可能通过下调CDC123蛋白来发挥抗增殖作用，从而在功能层面将CBD-CDC123这对相互作用与观察到的表型联系起来。

四、 主要研究结果

1. TPP成功应用于混合物靶点群筛选：研究首次将TPP技术系统地应用于天然产物混合物（HOE）的靶点发现。通过对SW620细胞裂解液进行TPP分析，成功鉴定出一个包含CDC123在内的潜在靶点蛋白集合。数据分析显示，HOE处理提高了整体蛋白质的热稳定性，并筛选出多个热稳定性发生显著变化的蛋白质（如CDC123、ALDH1B1、HDAC1等），证明了TPP具有从复杂混合物中高通量发现靶点群的能力。
2. CDC123被确立为关键治疗靶点：综合TPP结果、CETSA和SPR验证，CDC123被确认为HOE的直接结合靶点。生物信息学分析（TCGA、单细胞数据）显示CDC123在结直肠癌中高表达，功能实验（siRNA敲低）证明其是癌细胞增殖所必需的，从而确立了CDC123作为抗结直肠癌药物靶点的生物学合理性。
3. AUMS精准鉴定出特异性配体CBD：利用AUMS技术，从HOE中成功筛选并鉴定出与CDC123结合最强的成分为CBD。通过色谱、质谱比对和结合率计算，提供了确凿的质谱证据。这一结果将TPP发现的“靶点群”中的一员（CDC123）与混合物中的具体活性成分（CBD）直接关联起来。
4. CBD-CDC123相互作用得到多维度验证：分子对接和MD模拟从理论上预测了CBD与CDC123的结合模式与稳定性，指出了关键作用残基。SPR实验则提供了定量的结合亲和力数据（KD = 19.16 μM），从实验上确证了二者的直接、特异性相互作用。这构建了一个完整的“组分-靶点”验证链条。
5. CBD再现HOE的核心抗癌活性：药效学实验证明，纯品CBD在体外表现出与HOE混合物相似的选择性抗结直肠癌细胞增殖活性，并能同样地下调CDC123蛋白水平。这一结果不仅验证了CBD是HOE的关键活性成分之一，也表明通过ITPAUMS流程鉴定出的“CBD-CDC123”对应关系具有重要的功能意义，能够部分解释HOE的抗癌机制。

五、 研究结论与价值

本研究成功开发并验证了一种名为ITPAUMS的创新集成分析流程，用于系统性地解析复杂天然产物的作用机制。该研究以HOE为案例，首次实现了将TPP的高通量靶点群筛选能力与AUMS的精确配体鉴定能力相结合，成功构建了“CBD-CDC123”这一精确的“一对一”组分-靶点图谱。

科学价值： 1. 方法论创新：ITPAUMS为解决天然产物“多组分、多靶点”机制解析这一长期难题提供了一个强大、实用的实验性解决方案。它弥补了传统化学蛋白质组学需要标记、难以处理混合物的不足，也克服了单一TPP无法建立具体组分-靶点联系的局限。 2. 概念验证：研究首次成功将TPP应用于天然产物混合物的靶点筛选，并系统性地与下游的配体鉴定技术整合，证明了这种集成策略的可行性。 3. 机制发现：本研究不仅是一个方法学演示，更实质性地揭示了HOE抗结直肠癌作用的一个具体机制通路，即通过其主要成分CBD作用于CDC123靶点，为后续的深入研究和药物开发提供了明确线索。

应用价值： 1. 推动天然产物现代化研究：为中药复方、植物提取物、海洋天然产物等复杂体系的作用机制研究提供了强有力的新工具，有助于从“黑箱”整体观走向“白箱”机制阐明。 2. 加速药物发现：能够更高效、更准确地从天然宝库中发现新的活性先导化合物及其作用靶点，降低早期药物发现的盲目性和假阳性率。 3. 指导精准用药与配伍：通过绘制详细的“组分-靶点-通路”图谱，可以更好地理解天然产物协同作用的物质基础，为优化配方、提高疗效、减少副作用提供科学依据。

六、 研究亮点

1. 首创性集成策略：首次提出并将TPP与AUMS无缝集成，形成一套完整的、迭代式的天然产物机制解析新范式（ITPAUMS），兼具高通量、高特异性和无需标记的优点。
2. 成功解决关键难题：有效解决了长期以来天然产物混合物研究中“如何将整体靶点群与具体活性成分对应起来”的核心挑战，实现了从“面”（靶点群）到“点”（具体靶点），再到“线”（具体成分）的精准映射。
3. 完整的技术验证链：研究不仅展示了流程，还运用了包括TPP、AUMS、CETSA、SPR、分子对接、MD模拟、基因敲低、细胞功能实验在内的多维度技术，对每一个关键发现（靶点、配体、相互作用、功能）进行了严谨、交叉的验证，论证充分。
4. 具有示范意义的案例研究：选择机制不明的多组分HOE作为模型，使得方法学的演示具有真实的生物学意义和应用前景，而非单纯的技术展示。
5. 对领域局限性的清醒认识与展望：作者在讨论部分客观指出了ITPAUMS的潜在局限（如可能鉴定出非功能性结合靶点、流程相对耗时），并提出了未来的优化方向（如结合CRISPR-Cas9进行体内验证、开发自动化数据分析工具、整合其他如DARTS、LiP-MS等无标记技术以丰富靶点谱），体现了研究的深度和前瞻性。

七、 其他有价值内容

研究在讨论部分对现有天然产物靶点鉴定方法（如ABPP、蛋白芯片、功能组学、计算模拟）的优缺点进行了精炼的评述，凸显了开发ITPAUMS的必要性。同时，研究还通过HOE案例，额外提到了TPP筛选出的其他潜在重要靶点如ALDH1B1和HDAC1，这些靶点本身在癌症中已知具有重要作用，这进一步印证了ITPAUMS在发现新靶点方面的潜力，并暗示HOE的抗癌作用可能是通过作用于包括CDC123、ALDH1B1、HDAC1在内的多个靶点协同实现的。这恰好体现了ITPAUMS在揭示天然产物“多靶点”特性方面的优势。