本研究由Haoqing Chen、Lihua Yao、Christina Brown（明尼苏达大学梅森癌症中心与药物化学系）、Carmelo J. Rizzo（范德比尔特大学化学与生物化学系）以及通讯作者Robert J. Turesky（明尼苏达大学）合作完成，发表于Analytical Chemistry期刊（2019年5月4日）。
脱嘌呤/脱嘧啶（apurinic/apyrimidinic, AP）位点是DNA损伤的常见形式，是碱基切除修复（base excision repair, BER）途径的核心中间产物。AP位点可由烷基化、氧化应激、辐射或自发糖苷键断裂等多种因素引发。若未被及时修复，AP位点可能导致细胞毒性和突变。然而，文献中报道的AP位点水平差异巨大（从<0.67/10^6核苷酸到~1⁄10^5核苷酸），主要归因于DNA提取或处理过程中的人为假象（如酶促修复、酸碱条件导致的糖苷键断裂）。因此，本研究旨在开发一种在DNA分离前直接衍生化AP位点的方法，以最小化人为误差，并建立高灵敏度、高特异性的定量技术。
研究团队选择O-(吡啶-3-基-甲基)羟胺（pMOA）作为衍生化试剂，因其产物稳定性高且极性适中。通过单/双链寡核苷酸模型验证发现：
- 反应条件优化：在pH 7.4、37°C下，添加5 mM组氨酸催化剂可将衍生化时间从4小时缩短至1.5小时。
- 核蛋白裂解液中的反应加速：蛋白酶K消化后释放的氨基酸可能作为酸碱催化剂，进一步提高反应效率。
采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，以稳定同位素标记的[13C5]pMOA-脱氧核糖（[13C5]pMOA-dR）为内标，定量限低至0.9 fmol（2.2 AP位点/10^8核苷酸）。
- 色谱分离：使用C18反相柱，以2 mM醋酸铵/乙腈梯度洗脱。
- 质谱检测：监测m/z 241.1→92.0/108.0/110.0/125.0（pMOA-dR）及m/z 246.1→相同碎片（[13C5]pMOA-dR）。
为减少人为假象，研究设计“核裂解液直接衍生化”方法（Method A）：
1. 核分离：大鼠肝脏/肾脏组织匀浆后离心获取核沉淀。
2. 蛋白快速消化：加入蛋白酶K和SDS（1.5小时，37°C），抑制BER酶活性。
3. 原位衍生化：在核裂解液中直接加入pMOA反应1.5小时，随后用丁醛淬灭剩余试剂。
4. DNA纯化与酶解：RNase处理去除RNA，核酸酶P1/磷酸二酯酶I/碱性磷酸酶完全消化DNA。
5. 固相萃取（SPE）富集：使用Strata-X柱净化，LC-MS/MS定量。
健康大鼠肝核裂解液中，AP位点生成速率为0.29位点/10^7核苷酸/小时（前7小时线性区间），推算本底水平为0.50位点/10^7核苷酸（图3c）。
AP位点水平与氮芥浓度（3–100 μM）呈线性相关（图3e），验证了方法在宽动态范围内的适用性。
本研究建立了首个在核裂解液中直接衍生化AP位点的LC-MS/MS定量方法，通过规避DNA分离步骤，将人为假象降至最低。关键科学价值包括：
1. 方法学突破：提供了一种高灵敏度（亚fmol级）、高特异性的AP位点检测方案，解决了文献中数据差异大的问题。
2. 生物学意义：揭示了氧化应激下AP位点的真实积累水平，为DNA损伤修复机制研究提供可靠工具。
3. 应用潜力：适用于化疗药物（如烷化剂）的基因毒性评估及环境致癌物筛查。
（注：全文参考文献及支持信息可参见原文DOI: 10.1021/acs.analchem.9b01351）