肿瘤免疫学前沿研究：慢性应激通过β2-肾上腺素能受体信号通路驱动肿瘤微环境中T细胞功能耗竭与代谢失调的机制研究
本研究由来自美国纽约州布法罗市罗斯威尔公园综合癌症中心免疫学系的Guanxi Qiao、Minhui Chen、Hemn Mohammadpour、Cameron R. Macdonald、Mark J. Bucsek、Bonnie L. Hylander、Joseph J. Barbi以及Elizabeth A. Repasky共同完成。研究成果以题为“Chronic Adrenergic Stress Contributes to Metabolic Dysfunction and an Exhausted Phenotype in T Cells in the Tumor Microenvironment”的论文形式，发表于2021年6月的学术期刊《Cancer Immunology Research》（第9卷第6期）。
一、 研究的学术背景
该研究隶属于精神神经免疫学与肿瘤免疫学的交叉领域。长久以来，精神神经免疫学的研究者一直关注应激事件与免疫功能之间的关系。近年来的新发现指出，肿瘤生长本身可能依赖于神经发生和交感神经系统活性。研究表明，交感神经纤维可浸润肿瘤微环境，这为应激、神经刺激以及去甲肾上腺素等儿茶酚胺类物质影响肿瘤微环境提供了直接通道。此外，许多癌症患者在诊断后会经历慢性应激水平的升高，这可能影响包括免疫疗法在内的治疗效果。团队前期工作发现，慢性肾上腺素能应激会增加肿瘤浸润淋巴细胞中程序性细胞死亡蛋白-1的表达，并在体外实验中观察到β-肾上腺素能受体信号会抑制CD8+ T细胞活化期间的代谢重编程。然而，慢性应激如何具体影响肿瘤微环境中T细胞的功能状态，尤其是其代谢谱和耗竭表型，其机制尚不明确。
本研究旨在探究生理性慢性应激是否驱动了肿瘤微环境中T细胞的功能障碍或耗竭。具体研究目标包括：明确慢性肾上腺素能应激信号（通过β2-肾上腺素能受体）对肿瘤浸润T细胞耗竭表型（如抑制性受体表达）的影响；探究该信号对T细胞代谢功能（糖酵解和氧化磷酸化）的调控作用；阐明β-AR信号是否以及如何影响T细胞受体信号传导；最终，为“慢性应激是影响肿瘤免疫背景和抑制TILs活性的一个关键因素”这一观点提供机制性证据，并支持将减压或阻断β-AR信号作为联合免疫治疗的策略。
二、 详细研究流程
本研究是一项综合性的体内外实验研究，主要流程包含动物模型建立、表型分析、功能测定、机制探索等多个环节。
第一流程：动物模型构建与初步表型验证。 研究对象为8-12周龄的雌性小鼠，包括C57BL/6（用于B16-OVA黑色素瘤模型）、BALB/c（用于CT26.CL25结肠癌模型）、β2-AR基因敲除小鼠（背景分别为BALB/c和通过CRISPR技术构建的C57BL/6）、以及Nur77-GFP报告基因小鼠。研究巧妙地利用了“标准饲养温度”作为慢性应激模型：将小鼠饲养于机构动物护理和使用委员会要求的常温（22–23°C，ST），会使其因需要增加产热而经历由交感神经系统介导的轻度慢性肾上腺素能应激；而将小鼠饲养于热中性温度（30–31°C，TT）则能消除这种热应激。通过比较ST和TT条件下的小鼠，以及使用β-AR阻断剂普萘洛尔或β2-AR敲除小鼠，来研究肾上腺素能应激的影响。 具体操作：在小鼠左下腹部皮下注射2×10^5个B16-OVA或CT26.CL25肿瘤细胞。实验分组包括：1）ST vs TT饲养组；2）ST饲养下，野生型 vs β2-AR敲除组；3）ST饲养下，每日腹腔注射PBS（对照组）vs 普萘洛尔（200μg，治疗组）组。普萘洛尔处理通常在肿瘤植入前7天开始，持续至实验结束。肿瘤生长定期测量。实验终点（通常为植入后17-19天）收集肿瘤、脾脏和引流淋巴结。
第二流程：肿瘤浸润淋巴细胞表型与功能的流式细胞术分析。 对上述实验终点获取的肿瘤组织进行单细胞悬液制备（使用小鼠肿瘤解离试剂盒和gentleMACS解离器）。通过流式细胞术进行多色分析，检测指标包括： 1. 耗竭表型： 检测CD8+和CD4+ TILs上PD-1、TIM3、LAG3等抑制性检查点受体的表达频率和强度。使用转录因子TCF1和TIM3区分祖细胞耗竭T细胞和终末耗竭T细胞。 2. 共刺激分子： 检测CD28的表达。 3. 效应功能： 通过细胞内染色检测IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子的产生，以及FasL的表达。 4. 受体表达： 检测β2-AR在TILs及引流淋巴结T细胞上的表达。 5. 线粒体质量： 使用MitoTracker Green FM染料染色检测。 6. T细胞激活与代谢标志物： 在体外实验中，从 naïve 小鼠分离CD8+ T细胞，用抗CD3/CD28抗体激活，并加入或不加β-AR激动剂异丙肾上腺素。检测早期激活标志物CD69和葡萄糖转运蛋白GLUT-1的表达。 所有流式数据使用LSR Fortessa流式细胞仪采集，并用FlowJo软件分析。
第三流程：肿瘤浸润淋巴细胞代谢功能的直接测定。 这是一个关键的技术环节。从肿瘤、脾脏、引流淋巴结中分离CD8+ T细胞（使用CD8+ T细胞分选试剂盒），然后使用Seahorse细胞外通量分析仪进行实时代谢测定。 1. 线粒体压力测试： 评估氧化磷酸化功能。测量基础耗氧率、最大耗氧率和备用呼吸容量。试剂依次添加：寡霉素（抑制ATP合酶）、FCCP（解耦联剂，诱导最大呼吸）、鱼藤酮和抗霉素A（抑制线粒体呼吸链复合物I和III）。 2. 糖酵解压力测试： 评估糖酵解功能。测量细胞外酸化率。试剂依次添加：葡萄糖（诱导糖酵解）、寡霉素（抑制氧化磷酸化，迫使细胞最大程度依赖糖酵解）、2-脱氧-D-葡萄糖（抑制糖酵解）。 此方法直接、定量地反映了TILs在体内的代谢状态，是本研究方法学上的一个亮点。
第四流程：基因表达谱分析与信号通路机制探索。 1. Nanostring nCounter基因表达谱分析： 从B16-OVA肿瘤中分选出CD8+ TILs，提取RNA，使用包含561个免疫相关小鼠基因的Nanostring小鼠免疫学试剂盒进行分析。比较PBS处理组和普萘洛尔处理组TILs的基因表达差异，重点关注检查点分子、共刺激分子和细胞因子相关基因。 2. T细胞受体信号通路研究： * Western Blot分析： 从体外激活的CD8+ T细胞（在激活起始时或2小时后添加异丙肾上腺素）中，在不同时间点（5， 10， 20分钟）收集细胞，检测TCR下游关键激酶ZAP-70的磷酸化水平。 * Nur77-GFP报告基因系统： 利用从Nur77-GFP报告基因小鼠分离的CD8+ T细胞进行体外激活实验（加或不加异丙肾上腺素），GFP荧光强度反映Nur77的表达，从而间接指示TCR信号强度。此外，在B16黑色素瘤模型中，使用Nur77-GFP报告基因小鼠，通过流式检测体内TILs的GFP表达，评估β-AR阻断对TCR信号的影响。
第五流程：数据分析。 所有数据以均值±标准差呈现，使用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。组间肿瘤生长比较采用双向方差分析及Tukey检验，两组间数据比较采用非配对Student t检验。
三、 主要研究结果
1. β2-AR信号促进肿瘤生长，且TILs高表达β2-AR。 结果证实，与饲养在热中性温度的小鼠相比，经历慢性应激（ST）的小鼠肿瘤生长更快。在ST条件下，β2-AR敲除小鼠的肿瘤生长速度显著慢于野生型小鼠，证明了宿主β2-AR在介导慢性应激促瘤效应中的作用。流式分析发现，与引流淋巴结中的CD8+ T细胞相比，肿瘤浸润CD8+ T细胞表达β2-AR的频率和水平显著更高，这表明TILs可能对肾上腺素能应激信号更敏感。
2. 阻断β-AR信号可减少TILs的耗竭表型，增加祖细胞耗竭T细胞和CD28表达。 在两种肿瘤模型中，使用普萘洛尔阻断β-AR信号或使用β2-AR敲除小鼠，均能显著降低TILs上PD-1、TIM3、LAG3的表达，减少PD-1+TIM3+LAG3+三重阳性耗竭T细胞的比例。更重要的是，β-AR阻断增加了祖细胞耗竭T细胞（TCF1+TIM3-）的频率，同时减少了终末耗竭T细胞（TCF1-TIM3+）。即使在肿瘤已建立后再开始普萘洛尔治疗，虽然对肿瘤生长控制无显著差异，但每毫克肿瘤中祖细胞耗竭T细胞的绝对数量仍增加。这为β-AR阻断能增强抗PD-1疗法疗效提供了潜在解释。Nanostring分析进一步证实，β-AR阻断降低了CD8+ TILs中多个其他检查点基因和T细胞功能抑制基因的表达。 同时，阻断β-AR信号显著上调了TILs上共刺激分子CD28的表达，基因表达谱也显示其他共刺激分子表达上调。CD28信号对于逆转T细胞耗竭至关重要。
3. 阻断β-AR信号增强TILs的效应功能和代谢活性。 * 效应功能增强： Nanostring和流式分析一致表明，普萘洛尔处理组小鼠的CD8+ TILs产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、颗粒酶B等抗肿瘤细胞因子和效应分子的能力显著增强，而促炎细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10的表达降低。 * 线粒体功能改善： TILs通常线粒体质量较低，但β-AR阻断可部分挽救这种线粒体损失，增加CD8+和CD4+ TILs的线粒体质量。Seahorse分析显示，来自普萘洛尔处理组小鼠的CD8+ TILs，其基础耗氧率、最大耗氧率和备用呼吸容量均显著高于对照组，表明氧化磷酸化功能得到改善。这种改善在脾脏或引流淋巴结的T细胞中未观察到。 * 糖酵解能力提升： Seahorse分析显示，普萘洛尔处理组小鼠CD8+ TILs的基础细胞外酸化率和最大细胞外酸化率显著升高，表明糖酵解功能增强。
4. β-AR信号通过抑制早期TCR信号传导来损害T细胞激活和代谢重编程。 机制探索发现，在体外CD8+ T细胞激活过程中，如果在激活起始时（而非激活2小时后）加入β-AR激动剂异丙肾上腺素，会显著抑制早期激活标志物CD69和代谢关键蛋白GLUT-1的表达。Western Blot结果显示，异丙肾上腺素处理显著降低了ZAP-70的磷酸化水平，表明β-AR信号直接抑制了TCR信号传导。使用Nur77-GFP报告基因系统证实，无论在体外激活还是体内肿瘤模型中，β-AR信号都会抑制Nur77的表达（反映TCR信号减弱），而β-AR阻断则增强之。这揭示了β-AR信号抑制T细胞功能的上游机制：通过削弱早期TCR信号，进而阻碍后续的代谢重编程（糖酵解和氧化磷酸化上调）和效应功能获得，最终导向耗竭表型。
四、 研究结论与意义
本研究得出结论：慢性的肾上腺素能应激（如癌症患者常经历的心理应激或本研究中的生理性冷应激）通过激活β2-肾上腺素能受体信号，在肿瘤微环境中扮演了一个此前未被充分认识的“免疫检查点”角色。该信号通路直接抑制肿瘤浸润T细胞的TCR信号传导，导致其代谢重编程受阻（糖酵解和氧化磷酸化功能受损），进而促进其向功能耗竭表型分化（高表达多种抑制性受体，效应功能低下），同时减少具有更强增殖和抗肿瘤潜力的祖细胞耗竭T细胞。
科学价值： 本研究首次在体内系统性地揭示了慢性应激通过神经-免疫轴（交感神经-β2-AR信号）直接调控肿瘤微环境中T细胞代谢与功能状态的完整机制链条，将精神神经免疫学与肿瘤免疫学、免疫代谢等领域紧密连接，为理解肿瘤免疫抑制的复杂调控网络增添了关键一环。
应用价值与重要观点： 1. 为联合治疗提供强有力理论依据： 研究结果强烈支持将减压策略或β-受体阻滞剂（如普萘洛尔）与现有免疫检查点抑制剂（如抗PD-1疗法）联合使用。β-AR阻断可能通过改善TILs代谢、减少终末耗竭、增加祖细胞耗竭T细胞和CD28表达，来“重塑”肿瘤免疫微环境，使“冷肿瘤”变“热”，从而提高免疫疗法的响应率。 2. 提出β-AR作为新的可靶向免疫检查点： 作者明确提出，鉴于β-AR信号对免疫细胞（尤其是T细胞）的广泛抑制作用，其本身可被视为一个潜在的“免疫检查点”，β-受体阻滞剂可被重新用作免疫治疗的辅助药物。 3. 关注患者心理生理状态： 研究强调了临床实践中关注和管理癌症患者慢性应激的重要性，因为这可能直接影响依赖TILs状态的各类疗法（尤其是免疫疗法）的最终疗效。
五、 研究亮点
六、 其他有价值内容
研究在讨论部分也提出了未来需要深入探索的方向，例如：需要构建T细胞特异性β2-AR敲除小鼠以更精确地解析该信号在T细胞内的作用；需要厘清β-AR信号抑制代谢重编程是否依赖于CD28；需要探究β-AR信号如何影响其他免疫细胞（如髓源性抑制细胞、树突状细胞）并整合这些效应来调控整体抗肿瘤免疫反应；以及需要在人类样本中验证类似表型变化。这些思考为该领域的后续研究指明了路径。