本研究由Mengmeng Chang、Qingqing Wang、Xinyu Liu、Xianzhe Shi和Guowang Xu等人完成，主要作者来自中国科学院大连化学物理研究所（CAS Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences）以及中国科学院大学（University of Chinese Academy of Sciences）。该研究成果发表于Analytical Chemistry期刊，于2021年3月13日投稿，2021年7月21日被接收，文章DOI为https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c01101。
本研究的学术背景主要围绕线粒体代谢组学以及肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的代谢特征展开。线粒体是细胞内具有双层膜结构的细胞器，参与三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle, TCA）、脂肪酸β氧化（β-oxidation）、尿素循环、ATP生成以及细胞凋亡调控等核心代谢过程。线粒体代谢异常与多种疾病的发生发展密切相关，尤其是神经退行性疾病和癌症。肝细胞癌作为一种高发病率和高死亡率的原发性肝脏恶性肿瘤，其早期诊断和发病机制研究高度依赖代谢标志物的发现。肝脏细胞富含线粒体，线粒体在整合碳水化合物、脂质和蛋白质代谢中起枢纽作用，线粒体功能障碍可能在HCC进展和转移中扮演重要角色。然而，目前对肝细胞线粒体代谢组的直接、无干扰分析仍较少。传统线粒体纯化主要依赖于差速离心（differential centrifugation, DC）和蔗糖密度梯度超速离心（ultracentrifugation, UC）。DC操作简单但纯度低，UC纯度高但耗时长、步骤繁琐且可能改变代谢物丰度。亲和纯化策略因抗体与细胞器标志蛋白之间的高特异性结合而受到关注，但已有方法多依赖于商业磁珠或转基因细胞系，存在操作复杂、抗体种类受限、成本高等问题。因此，本研究旨在开发一种简便、高效、高选择性的免疫亲和磁复合材料，用于从不同肝细胞中纯化完整线粒体，并进一步开展线粒体代谢组学分析，以揭示线粒体水平与全细胞水平代谢组的差异及其在HCC中的潜在意义。
研究的工作流程主要包括以下几个方面：首先是复合材料的合成与表征。研究团队首先通过一步溶剂热法合成了磁性石墨烯（magnetic graphene, MAGG）复合材料，然后在其表面通过碱性条件下多巴胺的聚合包覆一层聚多巴胺（polydopamine, PD），得到MAGG@PD。随后利用聚多巴胺与胺基之间的反应将亲和素（avidin）固定在MAGG@PD表面，形成MAGG@PD@avidin。同时，将抗TOM20抗体（anti-TOM20 antibody）和用于对照的IgG分别进行生物素化，再通过生物素-亲和素相互作用将其连接到MAGG@PD@avidin上，最终得到MAGG@PD@avidin@TOM20免疫亲和磁复合材料。该复合材料结合了Fe3O4的快速磁响应性、石墨烯的大比表面积、聚多巴胺的良好生物相容性和潜在反应活性以及生物素-亲和素之间的高亲和力。表征结果显示，MAGG@PD的透射电镜图像中可见约10 nm厚的聚多巴胺壳层，傅里叶变换红外光谱证实了MAGG和MAGG@PD的结构特征。以生物素化IgG为模型评估结合容量，结果显示MAGG@PD@avidin对生物素化IgG的饱和结合容量可达570 μg/mg，比常用商业材料高10至50倍。
其次是线粒体的分离与纯度、完整性鉴定。研究使用LO2、HepG2和Huh7三种肝细胞作为研究对象。细胞培养至近100%汇合后收集，经PBS和线粒体分离缓冲液洗涤，在含1 mM PMSF的冰冷缓冲液中用Potter-Elvejhem匀浆器进行40次轻柔连续匀浆，使约50%细胞裂解。匀浆液在1000g离心两次以去除细胞核、细胞碎片和未破碎细胞，收集上清后在10000g离心10分钟获得富含线粒体的沉淀。将该沉淀重悬后与预洗的MAGG@PD@avidin@TOM20在4 °C下温和旋转孵育30分钟，用磁铁收集结合有线粒体的复合材料并洗涤三次。整个分离过程在冷室中进行并使用冰冷溶液。作为对照，研究还采用蔗糖阶跃密度梯度超速离心法分离线粒体。通过Western blot检测线粒体标志物PDH-E1α和VDAC、细胞质标志物β-actin、细胞核标志物histone H3、溶酶体标志物LAMP1和内质网标志物calnexin，评估两种方法获得的线粒体纯度。结果显示，MAGG@PD@avidin@TOM20获得的线粒体组分中PDH-E1α和VDAC显著富集，β-actin、histone H3和LAMP1未检测到，calnexin信号较弱，表明该方法纯度高且与蔗糖阶跃密度梯度超速离心相当。线粒体完整性通过MitoTracker Deep Red FM染色和荧光显微镜表征，结果显示结合在MAGG@PD@avidin@TOM20上的线粒体可被MitoTracker标记，说明分离的线粒体保持完整且具有膜电位。
再次是代谢物提取与非靶向代谢组学分析。将结合线粒体的磁性材料用KPBS洗涤后，加入200 μL冰冷80%甲醇水溶液提取线粒体代谢组，提取液中含有同位素标记内标。提取液经磁分离、18000g离心、冻干后复溶于80 μL甲醇/水（4:1）中，再次离心后转移至进样瓶。全细胞代谢物提取按照补充材料中的详细流程进行。采用超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）进行非靶向代谢组学分析。正离子模式下使用BEH C8色谱柱，流动相为含0.1%甲酸的水和含0.1%甲酸的乙腈；负离子模式下使用HSS T3色谱柱，流动相为含6.5 mM NH4HCO3的水和甲醇/水（95:5）。质谱采用Q Exactive HF，正负离子模式喷雾电压分别为3.50 kV和3.00 kV，毛细管温度320 °C，全扫描分辨率120000，数据依赖性二级质谱分辨率30000。数据通过与包含约2000种代谢物的自建数据库比对进行代谢物鉴定。每种细胞进行三个生物学重复。
研究的主要结果包括：在三种肝细胞来源的免疫纯化线粒体中共鉴定到95种化合物，涵盖有机酸（如柠檬酸、苹果酸、柠苹酸）、脂肪酸（如棕榈油酸、肉豆蔻油酸、二十二碳六烯酸）以及已知线粒体代谢物（如NAD和AMP），这些代谢物与TCA循环、β氧化和能量代谢相关。全细胞代谢组学共鉴定到234种化合物。通过比较HepG2和Huh7相对于LO2在相同全细胞和线粒体水平上的代谢物变化热图，发现代谢物在全细胞和线粒体水平的变化幅度和方向存在明显差异。衣康酸（itaconic acid）在全细胞和线粒体水平均上调，但线粒体内的升高程度显著更大。乙酰肉碱（acetylcarnitine）在线粒体中减少而在全细胞中增加。苹果酸（malic acid）在线粒体内升高但在全细胞代谢组中降低，且全细胞水平的差异未达到统计学显著性。这些结果表明，直接分析线粒体代谢组可以揭示被全细胞代谢组学掩盖的代谢变化。结合相关通路分析，衣康酸由顺乌头酸脱羧酶（cis-aconitate decarboxylase, CAD）催化顺乌头酸脱羧生成，CAD由免疫应答基因1（immune-responsive gene 1, IRG1）编码并定位于线粒体。衣康酸可抑制琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase, SDH），导致琥珀酸积累，进而激活缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α），调控糖酵解相关酶和细胞因子的表达。乙酰肉碱主要来源于β氧化的终产物乙酰辅酶A，HCC中线粒体β氧化显著下调，CPT2等脂肪酸氧化相关基因表达降低，因此线粒体内乙酰肉碱减少可能反映长链酰基辅酶A缺乏。乙酰肉碱/肉碱比值在HepG2（0.25）和Huh7（0.07）线粒体中低于LO2（约2），与β氧化下调趋势一致。苹果酸在全细胞中降低可能与其在细胞质中转化为丙酮酸并产生NADPH以支持HCC中增强的从头脂肪酸合成有关，该过程涉及柠檬酸-丙酮酸循环，且苹果酸酶1（malic enzyme 1, ME1）在HCC中表达上调。线粒体内苹果酸升高可能与其参与TCA循环和苹果酸-天冬氨酸穿梭以及癌细胞中氧化磷酸化下调有关。
本研究的结论是成功构建了一种简便、多功能的免疫亲和磁复合材料MAGG@PD@avidin@TOM20，能够高效、高选择性地从LO2、HepG2和Huh7三种肝细胞中纯化完整线粒体。该复合材料对生物素化IgG的饱和结合容量高达570 μg/mg，且可作为通用平台用于偶联其他生物素化抗体以纯化其他细胞器。与传统蔗糖阶跃密度梯度超速离心相比，该方法简化了操作步骤，避免了反复离心过程，能够明显降低对线粒体代谢物丰度的扰动。通过比较全细胞和线粒体代谢组，发现HCC细胞中部分代谢物在两种水平上呈现相反趋势或不同程度的变化，提示从线粒体水平进行分析对于更深入地理解HCC发病机制具有重要意义。
本研究的亮点在于：首次将聚多巴胺包覆的磁性石墨烯与生物素-亲和素系统及抗TOM20抗体结合用于线粒体免疫纯化，实现了高容量、高选择性和高稳定性的线粒体分离；该方法无需构建转基因细胞系，具有广泛的细胞适用性；通过全细胞与线粒体代谢组的直接对比，揭示了衣康酸、乙酰肉碱和苹果酸等代谢物在HCC中的差异化变化，证明了线粒体代谢组分析在揭示疾病相关代谢重编程中的独特价值。