金纳米棒与纳米羟基磷灰石复合水凝胶用于术后光热治疗与骨再生预防骨肿瘤复发

主要作者廖金凤、石坤、贾燕鹏、吴燕婷、钱志勇等来自四川大学华西医院口腔疾病研究国家重点实验室及生物治疗国家重点实验室。该研究发表于 Bioactive Materials 期刊2021年第6卷，第2221至2230页，于2021年1月22日在线发表。

骨肉瘤是一种高度恶性的梭形细胞肉瘤，好发于青少年，严重威胁儿童及青少年健康。目前临床治疗以手术切除为主，辅以术后化疗和放疗。然而，手术难以保证彻底清除骨组织周围的残余肿瘤细胞，这是导致术后复发和转移的主要原因，患者死亡率居高不下。同时，骨肉瘤侵袭及手术干预会造成大面积的骨缺损，机体难以自行修复，严重影响患者生活质量。因此，迫切需要开发能够同时清除术后残余肿瘤并促进骨缺损修复的新型治疗策略。光热治疗利用近红外光照射下的光热转换剂将光能转化为热能，从而引起肿瘤细胞膜损伤、蛋白质变性及细胞坏死，是一种有效的、非侵入性的局部肿瘤治疗方法。金纳米棒因其强近红外吸收、良好的生物相容性及光热稳定性，被广泛用作高效光热剂。此外，水凝胶具有三维多孔网状结构、良好的生物相容性和可降解性，能够模拟细胞外基质，促进间充质干细胞的增殖与成骨分化。纳米羟基磷灰石是人体骨骼的主要无机成分，具有良好的骨修复效果，近年来还被证明具有肿瘤抑制能力。基于此，本研究设计并构建了一种金纳米棒/纳米羟基磷灰石复合甲基丙烯酰化明胶/甲基丙烯酰化硫酸软骨素水凝胶，以期实现术后残余肿瘤的光热清除和骨缺损再生修复的双重功能。

该研究的工作流程主要包括以下步骤：首先，采用种子介导法合成金纳米棒，并通过硫醇化聚乙二醇置换其表面的十六烷基三甲基溴化铵，以降低细胞毒性。透射电子显微镜显示制备的聚乙二醇化金纳米棒长度约为48纳米、宽度约为12纳米，紫外-可见吸收光谱显示其在近红外区具有强吸收，峰值位于约808纳米。其次，将甲基丙烯酰化明胶与甲基丙烯酰化硫酸软骨素按一定比例混合，加入金纳米棒和纳米羟基磷灰石，在蓝光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸锂的存在下，通过蓝光照射2分钟制备复合水凝胶。扫描电子显微镜观察显示冻干水凝胶具有多孔结构，平均孔径约为76微米，元素分布分析证实金和磷元素在水凝胶中均匀分布。机械性能测试显示水凝胶的弹性模量为0.67兆帕，在62%压缩应变下达到极限应力，且在三次连续的加载-卸载压缩循环后仍保持完整，具有良好的抗疲劳性能。此外，研究还利用猪皮和猪骨组织评估了水凝胶的光热穿透深度。在体外细胞实验中，将K7M2wt小鼠骨肿瘤细胞与水凝胶共培养，用不同功率密度的808纳米激光照射5分钟，通过活/死细胞染色和细胞活力测定评估光热杀伤效果。同时，通过浸提液法评估了水凝胶对NIH3T3成纤维细胞和K7M2wt细胞的细胞毒性。在骨髓间充质干细胞培养实验中，细胞接种于水凝胶表面，分别在1、3、5天通过扫描电子显微镜观察细胞黏附与增殖形态，并通过MTT法测定细胞增殖率；在成骨诱导培养基中培养14天后，采用茜素红染色评估细胞外基质矿化程度。体内实验中，将水凝胶植入BALB/c小鼠背部皮下，观察1、2、4周后的降解情况及周围组织的苏木精-伊红染色结果。此外，通过将K7M2wt细胞皮下注射构建肿瘤模型，再将肿瘤组织切成小块植入小鼠胫骨附近，建立骨肿瘤模型。将荷瘤小鼠随机分为对照组、手术组、手术+水凝胶组和手术+水凝胶+光热治疗组，每组5只。手术切除大部分肿瘤后，在残留肿瘤部位植入水凝胶并用808纳米激光以0.99瓦/平方厘米的功率密度照射5分钟，记录红外热成像、肿瘤体积、体重及生存率。治疗2周后处死另一批小鼠，取胫骨进行微型计算机断层扫描和苏木精-伊红染色，同时对心、肺、肝、脾、肾及复发肿瘤进行组织学检查。

研究结果显示，聚乙二醇化金纳米棒具有均匀的形貌和良好的近红外吸收特性。复合水凝胶在不同功率密度激光照射下表现出可控的升温能力，温度分别达到35.0摄氏度、47.1摄氏度和57.6摄氏度，而空白水凝胶未出现升温。猪骨和猪皮组织的加热穿透深度分别约为3.7毫米和4.5毫米，表明光热治疗在体内组织中的热扩散有限，因此术后局部治疗策略更符合临床需要。体外光热实验显示，随着激光功率密度的增加，K7M2wt细胞死亡率显著上升，在0.99瓦/平方厘米时细胞活力仅为1.2%，说明该复合水凝胶能够有效杀灭骨肿瘤细胞。细胞毒性实验显示，即使在高浓度浸提液条件下，NIH3T3和K7M2wt细胞活力仍大于80%，表明水凝胶具有良好的细胞相容性。骨髓间充质干细胞在水凝胶表面能够良好黏附、铺展和增殖，细胞活力在培养3天和5天后分别增加25%和58%。茜素红染色显示，水凝胶组的矿化结节密度明显高于对照组，矿化细胞外基质含量比对照组高65%，表明复合水凝胶能够促进间充质干细胞的成骨分化。体内生物相容性实验显示，水凝胶在皮下植入后随时间逐渐降解，第一周周围结缔组织中有少量巨噬细胞和淋巴细胞浸润，随后炎症细胞数量逐渐减少，表明水凝胶具有可接受的生物相容性。体内抗肿瘤实验表明，手术+水凝胶+光热治疗组小鼠在激光照射后残余肿瘤区域中心温度迅速升高并维持在约53.8摄氏度，周围正常组织温度约为40摄氏度，能够在不损伤周围健康组织的前提下选择性破坏残余肿瘤。该组小鼠肿瘤未出现复发，体重持续增加，观察期内全部存活；而对照组、手术组和手术+水凝胶组小鼠肿瘤复发并快速生长，体重下降，生存期分别明显缩短。组织学检查显示，手术+水凝胶+光热治疗组小鼠各主要器官未见肿瘤转移，而其他三组小鼠肺部可见小的肿瘤结节及出血点。微型计算机断层扫描显示，手术+水凝胶+光热治疗组小鼠胫骨骨缺损区域出现新骨再生，骨体积显著高于其他组，表明该复合水凝胶能有效促进骨缺损修复。

本研究的结论是：成功构建了一种兼具光热治疗和骨再生功能的金纳米棒/纳米羟基磷灰石复合水凝胶。该水凝胶能够通过光热效应有效清除术后残余骨肿瘤细胞，防止肿瘤复发，同时通过模拟细胞外基质促进骨髓间充质干细胞的成骨分化和骨缺损修复。这一双功能水凝胶平台不仅适用于骨肉瘤，还可为口腔癌导致的颌面缺损及恶性肿瘤骨转移等复杂疾病提供新的治疗策略。

该研究的亮点在于：首次将金纳米棒与纳米羟基磷灰石共同引入甲基丙烯酰化明胶/甲基丙烯酰化硫酸软骨素水凝胶体系，实现了术后光热治疗与骨再生的原位协同；采用温和快速的蓝光光聚合方法制备水凝胶，操作简便且对细胞友好；体内实验证实该水凝胶在杀灭残余肿瘤的同时能够促进骨缺损修复，为骨肿瘤相关复杂疾病的治疗提供了新思路。