CD28共刺激驱动肿瘤浸润T细胞糖酵解以促进炎症 ——一项关于肾细胞癌免疫代谢微环境与T细胞功能调控的深度研究
本研究由Kathryn E. Beckermann等研究人员共同完成。主要作者单位包括美国范德堡大学医学中心（Vanderbilt University Medical Center）的血液学与肿瘤学部、病理学、微生物学与免疫学系、细胞与发育生物学系以及免疫生物学中心；德国雷根斯堡大学医院（University Hospital Regensburg）的内科三系；以及美国北卡罗来纳大学教堂山分校（University of North Carolina, Chapel Hill）的Lineberger综合癌症中心等多个机构。该研究于2020年8月20日发表在 JCI Insight 期刊上，文章编号为2020;5(16):e138729，DOI为10.1172/jci.insight.138729。这是一篇开放获取（Open Access）的研究文章。
本研究属于肿瘤免疫学与免疫代谢学的交叉领域。T细胞是抗肿瘤免疫的核心效应细胞，但其在肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中的功能常常受到抑制，导致免疫逃逸。研究背景聚焦于T细胞代谢重编程（Metabolic Reprogramming）对其命运和功能的关键决定作用。已知，静息T细胞主要依赖氧化磷酸化获取能量，而活化的效应T细胞需要迅速切换为高糖酵解（Aerobic Glycolysis）和增强的线粒体代谢，以支持其增殖、细胞因子分泌和杀伤功能。这一过程受到共刺激信号（如CD28）和共抑制信号（如PD-1， CTLA4）的精密调控。
先前的研究表明，肾细胞癌（Renal Cell Carcinoma, RCC）的肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs），特别是CD8+ TILs，存在广泛的代谢缺陷，包括葡萄糖摄取与糖酵解能力下降，以及线粒体功能紊乱（如碎片化、呼吸能力降低）。RCC对PD-1/CTLA4免疫检查点阻断疗法有一定反应，但应答率有限，且T细胞浸润丰度与患者生存改善不相关，提示RCC的TME存在独特的免疫抑制机制。然而，代谢缺陷与共刺激信号通路在RCC CD8+ TILs功能调控中的具体作用和关联尚不明确。
基于此，本研究旨在探究共刺激信号（特别是CD28）是否能逆转RCC CD8+ TILs的代谢抑制状态，恢复其效应功能，并阐明其背后的代谢机制。研究的核心科学问题是：CD28共刺激如何影响RCC CD8+ TILs的代谢表型和功能？葡萄糖代谢在其中扮演何种角色？
本研究采用了多层次、多组学的综合性实验策略，流程严谨，从表型描述深入到机制验证。
第一步：RCC CD8+ TILs的表型特征分析 * 研究对象与样本量：从5名RCC患者的肿瘤组织、匹配的癌旁肾组织及外周血中分离CD8+ T细胞。另有来自更多患者（总计44名）的样本用于后续功能实验。 * 处理与实验方法： 1. 转录组学分析：对配对的肿瘤CD8+ TILs与外周血CD8+ T细胞进行RNA测序（RNA-seq）。使用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）和CIBERSORT算法，比较两者在免疫相关和代谢相关通路基因表达上的差异，并对T细胞亚群进行组成分析。 2. 单细胞蛋白质组学分析：利用质谱流式细胞技术（CyTOF），对来自3名患者的配对肿瘤、癌旁组织和外周血样本进行高维表型分析。使用自定义的金属标记抗体面板，同时检测免疫表型标志物（如PD-1， CD127）和代谢标志物（如GLUT1葡萄糖转运蛋白， ATP5A线粒体ATP合酶亚基， 细胞色素C等）。 3. 数据分析：采用t-SNE降维可视化、地球移动距离（Earth Mover‘s Distance, EMD）量化样本间差异，以及标记物富集模型（Marker Enrichment Modeling, MEM）定量描述特定细胞群的表型和代谢特征。
第二步：CD28共刺激对TILs功能的影响评估 * 研究对象：从RCC患者的外周血、肿瘤组织及癌旁肾组织中分离的CD8+ T细胞，以及健康供者的外周血单个核细胞（PBMCs）作为对照。 * 处理与实验方法： 1. 体外刺激：将细胞培养5天，设置不同刺激条件：仅用IL-7维持生存（未刺激对照）；仅用抗CD3抗体刺激T细胞受体（TCR）；用抗CD3加抗CD28抗体进行共刺激。 2. 功能检测：通过流式细胞术检测T细胞活化标志物（CD25， CD71）和效应功能分子（颗粒酶B）的表达水平。
第三步：单细胞分辨率下的基因表达与代谢状态解析 * 研究对象：来自健康供者PBMCs和RCC肿瘤单细胞悬液的CD8+ T细胞。 * 处理与实验方法： 1. 刺激与测序：细胞在IL-7、抗CD3、抗CD3/CD28、或抗CD3/CD28/IL-2条件下培养5天后，进行10x Genomics单细胞RNA测序（scRNA-seq）。 2. 数据分析：使用UMAP、PHATE和Monocle等先进算法进行降维、轨迹推断和细胞状态聚类分析。通过基因集富集分析和AUCell评分，定义不同细胞状态（分支）的代谢与信号通路特征（如“静息态”、“IL-2信号与糖酵解分支”、“氧化磷酸化分支”）。 3. CyTOF验证：对刺激后的健康供者PBMCs和RCC TILs进行CyTOF分析，从蛋白水平验证scRNA-seq发现的表型变化，特别是活化标志物和代谢蛋白的表达改变。
第四步：CD28共刺激对TILs代谢的直接测量 * 研究对象：从RCC肿瘤中分选的CD8+ TILs。 * 处理与实验方法： 1. 代谢通量分析：使用Seahorse细胞能量代谢分析仪，测量不同刺激条件下（IL-7， 抗CD3， 抗CD3/CD28）细胞的糖酵解能力（通过细胞外酸化率ECAR表示）和线粒体呼吸能力（通过耗氧率OCR表示）。 2. 葡萄糖转运蛋白检测：通过流式细胞术，检测不同刺激条件下GLUT1和GLUT3葡萄糖转运蛋白在蛋白水平的表达变化。
第五步：葡萄糖代谢在CD28共刺激挽救TIL功能中的关键作用验证 * 研究对象：RCC CD8+ TILs。 * 处理与实验方法： 1. 代谢干预实验： * 在刺激体系中添加糖酵解终产物丙酮酸，以绕过糖酵解直接为线粒体供能。 * 添加谷氨酰胺酶抑制剂CB-839，以抑制另一种代谢途径。 2. 糖酵解抑制实验：在CD3/CD28共刺激的同时，加入糖酵解竞争性抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose, 2-DG），阻断葡萄糖代谢。 3. 功能与线粒体检测： * 功能检测：流式细胞术检测活化标志物、效应细胞因子（IFN-γ， TNF-α， IL-2）和增殖情况（CellTrace Violet染色）。 * 线粒体结构与功能检测： * 结构：使用MitoTracker Deep Red染色，通过超高分辨率共聚焦显微镜观察线粒体网络形态（融合vs. 碎片化）。 * 功能与质量：使用TMRE检测线粒体膜电位，使用MitoTracker Green检测线粒体质量。
结果一：RCC CD8+ TILs表现出独特的免疫抑制和代谢紊乱表型。 RNA-seq分析显示，与匹配的外周血CD8+ T细胞相比，RCC CD8+ TILs不仅富集了耗竭和慢性激活相关的基因特征，其代谢相关通路基因表达也发生显著改变，提示糖酵解和线粒体代谢异常。CyTOF分析从单细胞蛋白水平证实了这一发现：RCC CD8+ TILs（尤其是PD-1+亚群）高表达PD-1，低表达CD127，并且线粒体电子传递链相关蛋白（如ATP5A， 细胞色素C）表达降低。这表明TILs处于一种“低代谢”的抑制状态。
结果二：CD28共刺激能有效挽救RCC CD8+ TILs的效应功能。 体外功能实验是关键发现。与单独TCR（CD3）刺激相比，CD3/CD28共刺激能显著提升大多数患者来源的RCC CD8+ TILs的活化标志物（CD25， CD71）和效应分子（颗粒酶B）的表达水平，其激活程度可达到甚至超过外周血CD8+ T细胞。而癌旁肾组织中的CD8+ T细胞则表现出一种“预激活”表型，对CD28共刺激无进一步反应。这证明，大量RCC TILs在功能上并未完全失能，而是处于一种“可唤醒”状态，CD28信号是关键的唤醒信号。
结果三：单细胞分析揭示CD28共刺激诱导TILs向代谢活跃状态转变。 scRNA-seq分析提供了高分辨率的机制线索。CD28共刺激驱使RCC CD8+ TILs从“静息”或“氧化磷酸化主导”状态，向两个不同的激活分支分化：一个分支富集IL-2/STAT5信号和糖酵解相关基因；另一个分支则同时富集糖酵解、氧化磷酸化和MYC信号通路基因。重要的是，葡萄糖转运蛋白GLUT3（而非GLUT1）的表达在激活分支（尤其是IL-2/糖酵解分支）中被特异性上调。这提示CD28共刺激可能通过诱导GLUT3来增强葡萄糖摄取。
结果四：CD28共刺激直接提升TILs的糖酵解和线粒体代谢能力。 Seahorse代谢通量分析直接证实了上述基因表达的预测。CD3/CD28共刺激显著提高了RCC CD8+ TILs的糖酵解速率（ECAR）和线粒体呼吸能力（OCR）。同时，流式细胞术验证了GLUT3蛋白水平在共刺激后显著升高，而GLUT1变化不大，明确了GLUT3是CD28共刺激诱导的关键葡萄糖转运蛋白。
结果五：葡萄糖代谢是CD28共刺激挽救TIL功能及线粒体健康的必要条件，其作用不可被完全替代。 这是本研究最核心的机制发现。 * 线粒体依赖葡萄糖代谢：显微镜观察显示，CD28共刺激能促进TILs中线粒体发生融合，形成更健康的网状结构。而抑制糖酵解（使用2-DG）则阻止了这种融合，导致线粒体进一步碎片化。同时，共刺激提升的线粒体膜电位和质量，也完全被2-DG所阻断。 * T细胞功能依赖葡萄糖代谢：最关键的是，2-DG处理完全抵消了CD28共刺激带来的所有益处：TILs的活化标志物表达、效应细胞因子产生（IFN-γ， TNF-α， IL-2， 颗粒酶B）以及增殖能力均被显著抑制。添加丙酮酸或抑制谷氨酰胺代谢只能在部分患者中有限地改善功能，无法完全替代葡萄糖代谢的作用。这证明，CD28共刺激通过驱动葡萄糖代谢（糖酵解），不仅为T细胞功能提供能量和生物合成前体，更重要的是，它维持了线粒体的结构完整性和功能性，而健康的线粒体又是T细胞完全活化和发挥效应功能所必需的。
结论：本研究表明，在肾细胞癌的肿瘤微环境中，CD8+ 肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的代谢和功能缺陷并非不可逆转。通过提供充分的CD28共刺激信号，可以显著恢复TILs的代谢活性，特别是驱动糖酵解代谢（通过上调GLUT3）并改善线粒体健康（促进融合、提升膜电位和质量），从而有效挽救其效应功能和增殖能力。这一挽救过程严格依赖于葡萄糖代谢。
科学价值： 1. 机制创新：研究明确了CD28共刺激→葡萄糖代谢（GLUT3介导）→线粒体健康→T细胞功能这一清晰的信号与代谢轴，揭示了葡萄糖代谢在支持线粒体结构和功能中的非能量供给性作用，深化了对T细胞代谢免疫学的理解。 2. 疾病特异性见解：为理解RCC免疫治疗应答率有限的生物学基础提供了新视角。研究指出，尽管RCC TILs高表达PD-1等抑制性受体，但其功能抑制与代谢缺陷紧密相连，而CD28信号是克服这种代谢抑制的关键开关。这解释了靶向CTLA4（其作用是抑制CD28信号）的联合疗法为何在RCC中可能有效。 3. 转化医学启示：研究为开发新的免疫治疗策略提供了潜在靶点。例如，直接靶向增强TILs的CD28信号通路、调控GLUT3表达或活性、或开发联合代谢调节剂（在保证葡萄糖可用性的前提下）以协同增强现有检查点抑制剂（如抗PD-1/PD-L1）的疗效，可能成为改善RCC等癌症免疫治疗的新方向。