LIM蛋白Ajuba通过抑制JAK1/STAT1/IFIT2网络促进结直肠癌细胞存活

主要作者与研究机构：本文由H Jia、L Song、Q Cong等完成，通讯作者为B Wang（上海交通大学医学院附属第九人民医院普外科）、H Peng（上海交通大学医学院附属上海同仁医院消化内镜中心）和Z Hou（上海交通大学医学院生物化学与分子细胞生物学系）。研究发表于Oncogene，2016年11月28日在线发表，DOI为10.1038/onc.2016.418。

学术背景：结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球常见的恶性肿瘤之一，其发生发展机制复杂，涉及多种信号通路的异常调控。Ajuba是一种LIM结构域支架蛋白（scaffold protein），属于zyxin/ajuba家族，含有C端串联LIM结构域和N端preLIM区域。Ajuba在细胞质中可与多种蛋白结合，参与调控细胞黏附、有丝分裂、DNA损伤反应、细胞分化、增殖和迁移等过程；在细胞核中则可作为转录共抑制因子或共激活因子发挥作用。然而，Ajuba在肿瘤发生和进展中的具体作用尚不清楚。干扰素（interferon，IFN）家族包括I型IFN（α、β）和II型IFNγ，在肿瘤免疫监视和免疫编辑中发挥关键的肿瘤抑制作用。IFN通过激活JAK（Janus kinase）/STAT信号通路发挥生物学效应，其中JAK1和STAT1是控制IFN刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）表达的主要信号分子。IFIT2（又称ISG54）是一种已知的肿瘤抑制因子和凋亡诱导因子，通过线粒体途径促进细胞凋亡。本研究旨在探究Ajuba在结直肠癌中的表达水平及其对肿瘤生长的调控作用，并阐明其分子机制。

研究流程：本研究首先通过Oncomine数据库分析Ajuba在多种肿瘤中的mRNA表达水平，发现结直肠癌中Ajuba表达显著升高。随后对67例配对的结直肠癌组织与癌旁组织进行免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色，检测Ajuba蛋白表达水平及亚细胞定位。为确定Ajuba对结直肠癌细胞生长的作用，研究者在SW-1116和Caco-2两种结直肠癌细胞系中分别建立了稳定敲低Ajuba（shAjuba）和稳定过表达Ajuba（Ajuba OE）的细胞模型，通过CCK-8实验检测细胞增殖，通过PI染色检测细胞周期，通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。进一步利用SCID小鼠皮下异种移植模型评价Ajuba对体内肿瘤生长的影响，并通过TUNEL实验检测肿瘤组织中凋亡细胞数量。为筛选Ajuba调控的下游靶基因，研究者对SW-1116-vector和SW-1116-Ajuba OE细胞进行了RNA-seq分析，并用qRT-PCR和Western blot验证差异表达的ISGs。为明确IFIT2在Ajuba抗凋亡功能中的必要性，研究者构建了稳定表达IFIT2的SW-1116-Ajuba细胞，通过CCK-8、凋亡检测和小鼠移植瘤实验评估其回复效应。为探讨Ajuba调控IFIT2表达的分子机制，研究者检测了IFNγ刺激下STAT1和STAT3的磷酸化水平，通过核质分离和免疫荧光实验观察STAT1的核转位情况。通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）实验在293T细胞中检测Ajuba与STAT1、JAK1、JAK2的相互作用。构建JAK1的系列截短突变体（全长、FERM结构域、其他结构域以及FERM结构域的1-142aa、143-284aa、285-426aa片段），分别与Ajuba共表达后进行Co-IP，以确定Ajuba与JAK1结合的具体区域。同时检测Ajuba对JAK1与IFNGR1结合的竞争性阻断作用。最后，在67例结直肠癌标本中通过IHC检测Ajuba、IFIT2和磷酸化STAT1（pSTAT1）的蛋白水平，并进行Pearson相关性分析。

主要结果：Oncomine数据库分析显示，结直肠癌中Ajuba mRNA水平在多个数据集中显著高于正常组织，其中Kaiser、Hong、Skrzypczak和Gaedcke数据集中分别高出7、6、5和5倍。在总计864例结直肠癌样本和297例正常样本的8个数据集中，Ajuba mRNA平均升高6倍。IHC结果显示，67例结直肠癌标本中53例呈Ajuba高表达，而癌旁组织中仅10例高表达，Ajuba蛋白主要定位于上皮细胞的细胞质中，其高表达与结直肠癌显著相关（P<0.0001）。此外，Ajuba家族的另一成员WTIP和LIMD1在结直肠癌中并未升高。功能实验表明，在SW-1116和Caco-2细胞中敲低Ajuba可显著抑制细胞生长，过表达Ajuba则促进细胞生长。体内移植瘤实验中，SW-1116-Ajuba细胞形成的肿瘤体积显著大于对照细胞，且TUNEL实验显示Ajuba过表达肿瘤中凋亡细胞数量明显减少。细胞周期实验表明Ajuba不影响细胞周期分布。凋亡检测显示，过表达Ajuba使SW-1116和Caco-2细胞在正常培养条件下对凋亡产生抵抗，而敲低Ajuba则增加细胞凋亡。在奥沙利铂（oxaliplatin）和MTA两种化疗药物处理下，过表达Ajuba的细胞表现出显著的化疗耐药性。RNA-seq结果显示Ajuba过表达导致一组ISGs表达下调，包括OASL、IFIT2、IFI44和HERC5。qRT-PCR和Western blot进一步证实Ajuba敲低上调IFIT2表达，而过表达则下调IFIT2表达。IFNγ和IFNα均能诱导包括IFIT2在内的ISGs表达，但IFNγ的诱导作用更强。Oncomine数据库显示IFIT2在结直肠癌中表达下调，与Ajuba表达呈相反趋势。在SW-1116-Ajuba细胞中恢复IFIT2表达可显著抑制细胞生长、逆转抗凋亡表型，并在体内抑制肿瘤生长。机制研究显示，在IFNγ刺激下，SW-1116-shAjuba细胞中STAT1磷酸化明显增强，而SW-1116-Ajuba细胞中STAT1磷酸化减弱，STAT3磷酸化无明显变化。核质分离和免疫荧光实验证实Ajuba过表达可阻断STAT1的核转位。Co-IP实验表明Ajuba不与STAT1结合，但特异性结合JAK1而不结合JAK2，且这种结合不依赖于IFNγ刺激。JAK1截短突变体实验显示Ajuba与JAK1的FERM结构域（1-142aa片段）结合。竞争性Co-IP实验证实Ajuba可阻断JAK1与IFNGR1的结合，且随着Ajuba表达量增加，JAK1与IFNGR1的结合逐渐被抑制。临床标本IHC分析显示，67例结直肠癌中59例呈现pSTAT1低表达或无表达，61例呈现IFIT2低表达或无表达，Pearson相关性分析表明Ajuba蛋白水平与pSTAT1及IFIT2水平呈显著负相关。

结论：本研究首次证明Ajuba在结直肠癌中高表达，并通过抑制细胞凋亡促进结直肠癌细胞的体外生长和体内肿瘤发展。机制上，Ajuba特异性结合JAK1的FERM结构域，阻断JAK1与IFNγ受体（IFNGR1）的结合，从而抑制STAT1磷酸化及其核转位，进而下调IFIT2等ISGs的表达，最终导致细胞凋亡抵抗。Ajuba在结直肠癌组织中的表达水平与IFIT2和pSTAT1呈负相关，进一步支持了这一分子机制在临床中的相关性。该研究揭示了Ajuba作为IFN信号通路特异性负调控因子的新功能，阐明了Ajuba-JAK1-STAT1-IFIT2轴在结直肠癌发生发展中的重要作用。

研究亮点：首先，本研究首次明确了Ajuba在结直肠癌中的致癌作用，发现其高表达可作为结直肠癌诊断的潜在标志物。其次，揭示了Ajuba调控IFN信号通路的新机制——不同于SOCS家族蛋白通过多种方式抑制细胞因子信号，Ajuba通过结合JAK1的FERM结构域竞争性阻断JAK1与IFNGR1的结合，这一发现为理解IFN信号通路的负调控机制提供了新视角。第三，明确了IFIT2作为Ajuba下游关键效应分子在介导凋亡抵抗中的重要作用，为结直肠癌的治疗提供了潜在靶点。第四，临床样本分析证实Ajuba与pSTAT1、IFIT2的负相关关系，表明该信号轴在临床结直肠癌中具有病理相关性。

其他有价值的内容：IFNγ在结直肠癌细胞中诱导IFIT2表达的能力强于IFNα，这一现象与免疫细胞中I型IFN是最强IFIT2诱导剂的传统认知不同，提示结直肠癌细胞可能存在特殊的IFNγ-STAT1-IFIT2调控机制。此外，过表达IFIT2并不能完全逆转Ajuba过表达导致的凋亡抵抗表型，表明Ajuba可能还调控其他基因参与凋亡抵抗，为后续研究提供了方向。该研究还提示Ajuba可能通过抑制IFN功能参与结肠炎相关结直肠癌的发生发展。