这篇文档属于类型a，是一篇关于PD-1信号通路如何影响线粒体功能及CD8+ T细胞耗竭的原创性研究。以下是详细的学术报告内容：

作者与发表信息

本研究由Jesús Ogando（第一作者）、Santos Mañes（通讯作者）等来自西班牙国家生物技术中心（CNB/CSIC）、安达卢西亚生物信息学中心（CAEBI）、庞培法布拉大学（UPF）等多个机构的团队合作完成，发表于Journal for Immunotherapy of Cancer（2019年，卷7，文章编号151）。研究通过开放获取（Creative Commons 4.0许可）发布。

学术背景

科学领域：免疫代谢学与肿瘤免疫治疗。
研究动机：PD-1/PD-L1抑制剂在癌症治疗中效果显著，但PD-1如何通过信号通路抑制T细胞功能的机制尚不明确。既往研究发现，PD-1通过抑制糖酵解和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）影响T细胞代谢，但线粒体结构与功能的具体变化未被阐明。
研究目标：揭示PD-1信号如何通过调控线粒体形态（如嵴结构）和功能（如呼吸链复合体组装）导致CD8+ T细胞耗竭，并探索其分子机制。

研究流程与方法

1. 实验设计与样本处理

• 研究对象：健康人外周血分离的CD8+ T细胞，通过负向筛选纯化（纯度86–95.5%）。
  
• 分组与刺激：
  
  • 静息组（Tctrl）：IgG1磁珠对照。
    
  • 激活组（Tact）：抗CD3/CD28抗体磁珠激活。
    
  • PD-1刺激组（Tact+PD1）：抗CD3/CD28+PD-L1-Fc融合蛋白共刺激。
    
• 样本量：每组3–18名供体，重复实验验证。
  

2. 转录组与代谢分析

• RNA测序（RNA-seq）：
  
  • 提取Tctrl、Tact、Tact+PD1细胞在6/24/48小时的RNA，Illumina平台测序（平均36M reads/样本）。
    
  • 使用GEMTools比对基因组（GENCODE v19），DESeq2分析差异基因，STEM聚类时间序列表达模式。
    
• 代谢功能检测：
  
  • Seahorse分析：测量细胞外酸化率（ECAR，糖酵解指标）和耗氧率（OCR，OXPHOS指标）。
    
  • 脂肪酸氧化（FAO）：以棕榈酸为底物，联合CPT1a抑制剂etomoxir验证PD-1对FAO的依赖。
    

3. 线粒体结构与功能研究

• 超微结构：透射电镜（TEM）定量线粒体数量、嵴长度及完整性。
  
• 呼吸链超级复合体（RCs）：蓝绿凝胶电泳（BN-PAGE）分析复合体I/III/IV组装。
  
• 基因沉默：慢病毒shRNA敲低CHCHD3（MICOS复合体组分），检测线粒体膜电位（ΔΨm）和IFN-γ产生。
  

4. 数据分析

• 生物信息学：GO/KEGG富集分析差异基因；Cytoscape构建代谢网络。
  
• 统计学：ANOVA、Kruskal-Wallis检验，GraphPad Prism 7.0处理。
  

主要结果

1. PD-1触发独特的转录程序

• 差异基因：578个基因在Tact+PD1中显著差异表达（FDR<0.05），富集于代谢通路（43个基因），包括糖酵解、OXPHOS和脂肪酸代谢。
  
• 关键下调基因：CHCHD3（MIC19）、CHCHD10（MIC14）等线粒体嵴组织系统（MICOS）组分。
  

2. 代谢重编程与线粒体功能障碍

• 糖酵解抑制：Tact+PD1的乳酸分泌和ECAR降低（p<0.01），与PD-L1剂量负相关。
  
• OXPHOS受损：基础OCR降低，但OCR/ECAR比值升高，提示PD-1促进FAO依赖的OXPHOS（类似记忆T细胞表型）。
  
• 线粒体结构异常：
  
  • TEM显示Tact+PD1线粒体嵴数量减少（p<0.001），长度缩短（p<0.01），部分线粒体无可见嵴。
    
  • CHCHD3敲低复现PD-1效应：ΔΨm下降（p<0.05），IFN-γ分泌减少（p<0.01）。
    

3. 呼吸链超级复合体（RCs）的意外增加

• BN-PAGE显示Tact+PD1中复合体I-III RCs富集（p<0.05），但功能仍受损，可能与MCJ/DNAJC15（RCs负调控因子）表达下调有关。
  

结论与意义

1. 科学价值：首次揭示PD-1通过下调MICOS组分（如CHCHD3）破坏线粒体嵴结构，导致代谢功能障碍，为T细胞耗竭提供了结构生物学解释。
   
2. 应用价值：靶向线粒体代谢（如FAO或嵴稳定性）可能增强PD-1阻断疗法的效果，尤其在肿瘤微环境中逆转T细胞功能。
   
3. 理论创新：提出PD-1信号不仅抑制TCR激活，还主动诱导独特的代谢表型，挑战了传统“单纯抑制”观点。
   

研究亮点

1. 多组学整合：结合RNA-seq、代谢组学和超微结构分析，全面解析PD-1的线粒体调控网络。
   
2. 技术创新：
   
   • 高分辨率TEM定量嵴形态，首次将PD-1与线粒体结构缺陷直接关联。
     
   • 原代CD8+ T细胞的CHCHD3基因沉默模型，验证了MICOS的关键作用。
     
3. 临床启示：RCs组装增加但功能受损的悖论现象，提示线粒体“代偿机制”的存在，为耐药性研究提供新方向。
   

其他价值

• 数据共享：RNA-seq数据公开于GEO（GSE122149），促进后续研究。
  
• 方法学细节：补充文件提供了实验步骤的完整描述（如BN-PAGE的数字化处理流程），增强可重复性。
  

（全文约2000字）