该文档发表于 Journal of Immunotherapy 2003年第26卷第2期，由来自意大利多个机构的 Laura Ridolfi、Ruggero Ridolfi、Angela Riccobon、Franca De Paola、Massimiliano Petrini、Monica Stefanelli、Emanuela Flamini、Alessandra Ravaioli、Giorgio Maria Verdecchia、Giusto Trevisan 和 Dino Amadori 共同完成。研究者们分别隶属于Istituto Oncologico Romagnolo (IOR)、Forlì的Pierantoni医院肿瘤内科、Forlì的Morgagni医院普外科以及的里雅斯特大学皮肤科。

本研究属于肿瘤免疫治疗领域，具体聚焦于恶性黑色素瘤的术后辅助治疗。研究的背景在于，尽管肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes, TIL）联合白细胞介素-2（Interleukin-2, IL-2）的过继性免疫疗法在治疗晚期黑色素瘤患者中显示出一定疗效，但理论上，这种疗法对于体内肿瘤负荷最小（即微小残留病灶）的患者应更为有效。因此，研究者假设，将TIL/IL-2联合方案应用于高风险（已切除转移灶的III期和IV期）黑色素瘤患者的辅助治疗，可能改善其预后。当时，此类患者的两年生存率较低（对于有软组织或肺转移的IV期患者为23-37%，对于有淋巴结大块转移的IIIC期患者为44-54%），且以干扰素为主的辅助治疗方案效果有限，IL-2在辅助治疗中的作用亦不明确。本研究旨在评估TIL/IL-2辅助治疗对于接受转移灶根治性切除术后处于无病状态的高复发风险黑色素瘤患者的疗效、耐受性，并探讨肿瘤局部免疫抑制对TIL功能的影响以及体外IL-2培养对其功能的恢复作用。

研究的详细工作流程包含多个紧密衔接的步骤。首先，患者入组与样本采集：从1993年2月至2001年6月，研究共入组25例（男11例，女14例，中位年龄54岁）接受转移灶（22例淋巴结、2例皮肤、1例肺）根治性切除术后的III-IV期黑色素瘤患者。所有患者入组时均处于无病状态。手术切除的转移灶组织是后续所有研究的起点。其次，TIL的体外培养与扩增：这是技术的核心环节。从转移灶组织中通过机械破碎和酶解（胶原酶IV、透明质酸酶V、DNA酶I）获得单核细胞悬液，随后在含有高剂量重组IL-2（6000 IU/mL）的AIM-V培养基中进行培养。细胞每3-4天稀释一次以维持增殖，当细胞总数超过0.5-1 × 10^9时，转移至培养袋中继续扩增。整个过程旨在大量扩增具有潜在抗肿瘤活性的淋巴细胞。培养结束后，通过细胞分离机浓缩细胞，最终获得用于回输的TIL（文中称为TIL-2）。同时，研究者对细胞产物进行了表型分析、微生物检测，并冻存了部分细胞和肿瘤细胞用于后续分析。从原发肿瘤中直接分离的TIL被称为TIL-1。第三，治疗实施：患者接受TIL回输联合大剂量IL-2静脉持续输注。治疗方案参照West方案，IL-2起始剂量为12 × 10^6 IU/m²/天，连续输注5天，休息1周后，再重复一个4.5天的疗程。根据患者的耐受情况（如低血压、少尿、肝肾功能异常等），IL-2剂量可下调。此外，所有患者在完成静脉治疗后，还接受了为期6个月的每月5天皮下IL-2（3 × 10^6 IU/天）维持治疗。第四，生物学标志物分析：这是阐明机制的关键部分。研究者采用免疫组织化学（对TIL-1和肿瘤组织）和免疫细胞化学（对TIL-2）方法，检测了T细胞受体（TCR）ζ链和ε链、信号转导分子p56lck、凋亡相关分子Fas和Fas配体（Fas-ligand）、以及Bcl-2和Bax的表达。目的是量化肿瘤微环境（TIL-1）对T细胞的免疫抑制状态，并验证体外IL-2培养（TIL-2）能否逆转这种抑制。同时，在部分病例（7例）中，对培养后的TIL-2进行了针对自体或异体黑色素瘤细胞的细胞毒性（51Cr释放）试验，以评估其特异性杀伤能力。第五，疗效与安全性评估：主要研究终点是无病生存期（DFS）和总生存期（OS）。患者定期接受随访以监测疾病复发和生存状态。治疗相关不良反应根据世界卫生组织标准进行分级记录。第六，统计分析：采用Kaplan-Meier法估算生存率，并运用Wilcoxon秩和检验和Spearman相关分析等非参数方法比较不同患者组间生物学标志物和IL-2剂量的差异。

研究获得了一系列重要结果。首先，在临床疗效方面：中位随访超过5年后，22例可评估患者中有8例（36.3%）保持无病生存。2年DFS和OS分别为44%和52%，3年DFS和OS分别为37%和45%。值得注意的是，在复发的14例患者中，有8例（57%）的复发部位仅为中枢神经系统（CNS），提示该疗法可能对CNS这一“免疫豁免”部位的监控效果有限。其次，IL-2剂量与疗效的相关性：数据显示，无病生存患者接受静脉IL-2的中位总剂量（110 × 10^6 IU）显著高于疾病进展患者（86 × 10^6 IU），提示IL-2的给药强度可能与临床获益相关。而两组间回输的TIL数量无显著差异。第三，TIL功能的生物学验证：这是本研究最具科学深度的发现。通过对12例患者（5例无病，7例进展）的配对样本分析发现，位于肿瘤内部的TIL-1其TCR ζ链、ε链和p56lck的表达水平极低或缺失，这直接证实了肿瘤微环境导致的T细胞功能受抑（“免疫麻痹”状态）。然而，经过体外IL-2培养后，TIL-2中这些关键信号分子的表达均得到显著恢复（p值均<0.001）。例如，TCR ζ链阳性细胞比例从培养前的0-49%上升至培养后的62-77%。同时，Fas配体的表达也从近乎为零显著增加。相反，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达在培养后显著下降。这些数据以表格形式详实呈现，有力地证明了体外IL-2培养能够有效逆转TIL的功能缺陷，使其重新获得激活和行使功能的能力。然而，这些功能恢复的程度在无病生存组和疾病进展组之间没有统计学差异，表明功能恢复是治疗的普遍效应，但可能并非决定临床结果的唯一因素。细胞毒性试验也证实，培养后的TIL-2对黑色素瘤细胞（中位杀伤率20%）具有比对对照细胞（中位3%）更高的特异性杀伤活性。第四，安全性与耐受性：治疗相关毒性主要为II-III级，包括发热、肌痛、低血压、心律失常、瘙痒和头痛等。有一例出现急性自身免疫性甲状腺炎。通过逐步降低IL-2剂量，所有患者均完成了治疗，未出现永久性的4级毒性，表明该方案在剂量调整下是可控的。

基于以上结果，本研究得出结论：对于接受转移灶根治性切除术的高风险黑色素瘤患者，采用TIL联合IL-2的过继性免疫辅助治疗，在长期随访中显示出改善无病生存和总生存的趋势。尽管受限于患者样本量较小，不能做出确定性结论，但观察到的生存数据令人鼓舞。研究进一步证实，肿瘤内部的TIL处于严重的功能抑制状态，而体外IL-2培养可以显著修复其信号转导和效应功能，这为该疗法的生物学合理性提供了直接证据。此外，研究提示，达到足够强度的IL-2系统给药可能对临床疗效至关重要，而中枢神经系统作为常见的复发部位，是未来联合治疗策略需要攻克的难点。

本研究的亮点在于：第一，研究设计的创新性：将原本用于晚期患者的过继性细胞疗法前瞻性地应用于辅助治疗场景，聚焦于微小残留病灶阶段，在理论上是更合理的策略探索。第二，机制研究的深度：不仅报告了临床结局，更通过详实的分子免疫学检测（TCR信号链、凋亡分子等），直观展示了TIL从肿瘤微环境中的“功能瘫痪”状态到体外扩增后“功能恢复”的动态过程，将临床研究与基础机制紧密结合，增强了结果的说服力。第三，长期的随访数据：中位超过5年的随访时间为评估这种干预措施的长期疗效提供了宝贵信息。第四，对治疗细节的深入分析：不仅关注了TIL，还分析了IL-2的剂量与疗效的潜在关联，为优化治疗方案提供了线索。第五，安全性管理的实践：通过灵活的剂量调整策略，证明了该强化治疗方案在密切监测下的可行性。

除了上述主要内容，研究还讨论了该领域面临的挑战，包括进行大规模随机对照试验的复杂性（由于TIL制备工艺复杂、成本高昂），并强调了需要进一步研究以明确IL-2在此联合方案中的最佳剂量、给药模式及其确切作用。这项初步研究为TIL/IL-2在高危黑色素瘤辅助治疗中的应用提供了初步证据和重要的生物学见解，指出了未来值得深入探索的方向。