学术研究报告

一、 研究作者、机构及发表信息

本研究的主要作者包括Pengfei Liu、Jie Zheng、Wenjing Ma、Jinhui Lü、Qian Zhao、Danni Li、Xiaoyan Jiang、Haikun Wang、Haiyun Wang和通讯作者Zuoren Yu。研究团队主要来自同济大学医学院上海东方医院医学创新中心以及同济大学生命科学与技术学院。此项研究以《Stress promotes lung metastasis in breast cancer by altering neutrophil differentiation》（《压力通过改变中性粒细胞分化促进乳腺癌肺转移》）为题，发表在学术期刊 Cancer Research 上，发表日期为 2026年1月1日，卷期为 86(1)。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于癌症生物学与免疫学交叉领域，重点关注心理压力（精神应激）在癌症进展，特别是转移过程中的作用。科学背景：乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，约90%的死亡归因于肿瘤转移，其中肺是乳腺癌常见的转移部位。除了年龄、遗传、激素水平等传统风险因素外，越来越多的证据表明，心理压力（如焦虑、抑郁）是乳腺癌进展和预后不良的重要风险因素。压力状态下，人体释放的儿茶酚胺和糖皮质激素等应激激素被认为介导了包括免疫抑制在内的大部分压力表型。已有研究表明，慢性应激（Chronic Stress, CS）可促进乳腺癌干细胞样特性，并影响抗肿瘤治疗反应。在转移机制方面，“种子与土壤”学说强调了远处组织的微环境（即转移前微环境）对于癌细胞定植的重要性。中性粒细胞作为关键的免疫细胞，在肿瘤发展中扮演着“双刃剑”的角色，既能直接杀伤肿瘤，也能通过多种机制促进转移。然而，在肿瘤负荷的个体中，慢性应激如何重塑转移前微环境，特别是如何影响中性粒细胞，其具体机制尚不明确。研究目的：鉴于大量乳腺癌患者经历心理压力，本研究旨在阐明慢性应激如何改变肿瘤微环境（尤其是中性粒细胞），并揭示其促进乳腺癌肺转移的内在调控机制，从而为预防或治疗转移提供新的潜在策略。

三、 详细研究流程与方法

本研究采用了多层次、多维度的实验体系，从动物模型构建到分子机制探索，流程严谨且系统。研究流程可概括为以下几个主要步骤：

1. 动物模型的构建与慢性应激处理：

   • 研究对象与样本量：研究使用了两种小鼠模型：(1) 自发乳腺肿瘤的 MMTV-PyMT 转基因小鼠（FVB/N背景）；(2) 通过原位移植 4T1 乳腺癌细胞建立的 BALB/c 小鼠荷瘤模型。样本量通常在每组5只（MMTV-PyMT行为学、血清检测等）至10只（4T1移植模型转移实验）不等。
   • 处理方法：对实验组小鼠施加为期3至4周的“不可预测慢性温和应激（CUMS）”。每日随机给予以下一种刺激：噪音、束缚、高台、摇动、体感刺激（夹尾）等。对照组（NC）小鼠正常饲养。
   • 验证与监测：通过旷场实验、悬尾实验和糖水偏好实验验证应激模型成功诱导了抑郁样行为。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清中应激激素皮质酮（Cort）和去甲肾上腺素（NE）水平显著升高。监测肿瘤生长和体重变化。

2. 表型验证：应激促进肿瘤生长与肺转移：

   • 实验方法：在MMTV-PyMT模型中，记录乳腺总肿瘤体积，并通过大体观察和苏木精-伊红（H&E）染色评估肺转移灶数量。在4T1移植模型中，在原位成瘤后，进行应激处理，最后通过尾静脉注射绿色荧光蛋白（GFP）标记的4T1细胞。4小时后处死小鼠，采用多种方法量化肺转移：(a) 肺组织H&E染色计数转移灶；(b) 流式细胞术检测肺单细胞悬液中CD45阴性/GFP阳性的外渗癌细胞数量；© 将肺单细胞悬液体外培养，计数形成的GFP阳性克隆，评估癌细胞的定植能力。
   • 结果：在两个模型中，慢性应激均显著促进了原发性乳腺肿瘤的生长，并大幅增加了肺部的转移病灶数量及外渗癌细胞的数目。

3. 单细胞转录组测序（scRNA-seq）解析肺微环境重塑：

   • 研究样本：取未发生转移（转移前）的MMTV-PyMT荷瘤小鼠的肺组织，分为应激组（CS）和对照组（NC）。
   • 实验方法：制备肺组织单细胞悬液，使用 10x Genomics 平台进行scRNA-seq。
   • 数据分析流程：
     • 质控与整合：使用 Cell Ranger 进行比对，使用 Seurat 软件包进行质控、标准化（SCT方法）和批次校正。
     • 细胞聚类与注释：通过主成分分析（PCA）和UMAP降维可视化，利用 SingleR 和已知的细胞标记基因（如Ptprc、Cd3e、Cd19、S100a8/9等）对细胞群进行注释，共鉴定出B细胞、T细胞、NK细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞（DC）、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞等11个主要细胞类型。
     • 差异分析：比较CS与NC组各细胞群的比例变化和差异表达基因（DEGs）。
   • 特殊分析：
     • 中性粒细胞亚群分析：对中性粒细胞进行重新聚类，鉴定出4个亚群（Neu1-Neu4）。发现Neu1在对照组中占主导，而Neu2在应激组中显著增加。
     • 轨迹推断：使用 CellRank 和 PAGA 进行拟时序分析，推断中性粒细胞亚群间的分化关系。
     • 细胞通讯分析：使用 CellChat 分析细胞间配体-受体相互作用。
     • 转录因子调控网络分析：使用 SCENIC（single-cell regulatory network inference and clustering） 分析不同中性粒细胞亚群中转录因子的活性。

4. 中性粒细胞功能验证与机制探究：

   • 中性粒细胞分离与鉴定：使用磁珠分选试剂盒（Mojosort）从荷瘤小鼠肺组织中分离中性粒细胞，并通过流式细胞术（CD11b+ Ly6G+）验证纯度。
   • 体外 Transwell 实验：将分离的肺源性中性粒细胞（来自NC或CS小鼠）置于下室，将乳腺癌细胞（MDA-MB-231或4T1）置于上室，共培养24小时后，检测癌细胞的侵袭能力。
   • 体内中性粒细胞清除实验：在4T1移植应激模型中，使用抗Ly6G抗体耗竭中性粒细胞，观察其对GFP-4T1细胞肺外渗的影响。
   • 应激激素的直接作用：将分离的对照小鼠中性粒细胞与CS小鼠血浆或皮质酮共培养，通过qRT-PCR检测特定基因表达变化。通过给荷瘤小鼠饮用含皮质酮的水，在体验证其效应。

5. 关键分子轴的鉴定与验证：

   • 关键基因鉴定：scRNA-seq分析发现，应激诱导的Neu2亚群（被命名为癌症应激启动中性粒细胞，Cancer Stress-Primed Neutrophils, Neu_CSP）高表达 Ccl3、Ccl4、Cxcl2、Il1r2 和 Cebpb（C/EBPβ）。而对照主导的Neu1亚群（癌症启动中性粒细胞，Neu_CP）则高表达Fos、Junb等基因。
   • 信号轴上游机制：
     • 皮质酮-C/EBPβ轴：通过公共 ChIP-seq 数据库分析，发现糖皮质激素受体 NR3C1 的结合峰位于 Cebpb 基因启动子区。实验证实皮质酮处理能上调中性粒细胞中C/EBPβ的表达。
     • C/EBPβ对Ccl3/Ccl4的转录调控：ChIP-seq分析显示C/EBPβ结合在 Ccl3 和 Ccl4 的启动子区。通过染色质免疫沉淀-聚合酶链反应（ChIP-PCR）、ChIP-qPCR以及荧光素酶报告基因实验，证实C/EBPβ能直接结合并激活 Ccl3 和 Ccl4 的转录。利用siRNA敲低 Cebpb 或分析已发表的 Cebpb 敲除（KO）中性粒细胞RNA-seq数据，均证实Ccl3/Ccl4表达下降。
   • 信号轴下游机制：
     • 配体-受体互作：CellChat分析提示Neu_CSP可能通过分泌CCL3/CCL4，与癌细胞表面的受体 CCR1 相互作用。
     • 体外功能验证：在Transwell实验中，添加重组CCL3或CCL4蛋白能促进癌细胞侵袭；使用CCL3/CCL4抑制剂前列腺素E2（PGE2）处理Neu_CSP，或使用CCR1抑制剂BX471处理癌细胞，或利用shRNA敲低癌细胞 *CCR1*，均能部分逆转Neu_CSP对癌细胞侵袭的促进作用。
     • 体内功能验证：
       • 靶向CCR1：构建 CCR1 敲除的GFP-4T1细胞，尾静脉注射至应激小鼠，发现其肺定植能力显著减弱，且在应激组中减弱效应更明显。
       • 靶向中性粒细胞CCL3/CCL4：开发了一种新型的脂质纳米粒包裹的CRISPR/Cas9系统，该系统使用中性粒细胞特异性启动子 HMRP8 驱动Cas9和靶向 Ccl3/Ccl4 的gRNA表达。通过尾静脉注射该纳米粒，可在体内特异性敲低中性粒细胞的CCL3/CCL4。结果显示，敲低CCL3/CCL4能显著抑制应激诱导的癌细胞肺定植。

6. 临床相关性分析：

   • 方法：利用公共数据库 KM-Plotter，对4929名乳腺癌患者的基因表达和生存数据进行分析。
   • 结果：高表达 CCR1 的乳腺癌患者具有更短的无进展生存期，且发生远处转移的时间更早。在淋巴结阳性患者中，这种关联更为明显。

四、 主要研究结果及其逻辑关联

本研究获得了一系列环环相扣的重要结果： 1. 表型确立：慢性应激成功诱导了小鼠的抑郁样行为，升高了应激激素水平，并显著促进了两种乳腺癌小鼠模型的肿瘤生长和肺转移。这为后续机制研究提供了明确的表型基础。 2. 微环境重塑图谱：scRNA-seq分析首次绘制了应激下乳腺癌肺转移前微环境的单细胞图谱。关键发现是，应激不仅改变了细胞组成（如显著增加中性粒细胞和内皮细胞比例，减少T、B、NK细胞比例），更重要的是诱导了中性粒细胞出现亚型转换。绝大多数对照组中性粒细胞为Neu_CP亚型，而应激后则转变为高表达CCL3/CCL4/C/EBPβ的Neu_CSP亚型。轨迹分析进一步支持了从Neu_CP向Neu_CSP分化的过程。这一发现将宏观表型与特定的免疫细胞亚群变化直接联系起来。 3. 中性粒细胞的功能核心地位：体外实验证明，来自应激小鼠肺部的Neu_CSP比对照中性粒细胞具有更强的促进癌细胞侵袭的能力。体内通过抗Ly6G抗体清除中性粒细胞，可以显著抑制应激所促进的癌细胞肺外渗。这些结果确立了中性粒细胞，特别是Neu_CSP亚群，是应激促进转移的关键效应细胞。 4. 分子机制解析——压力-激素-转录-趋化轴： * 上游启动信号：应激激素皮质酮是诱导Neu_CSP的关键上游信号。其受体NR3C1直接调控转录因子C/EBPβ的表达。 * 核心转录调控：C/EBPβ作为核心转录因子，直接结合并激活 Ccl3 和 Ccl4 基因的转录，从而赋予了Neu_CSP独特的分泌表型。这一系列实验（从数据库分析到ChIP、报告基因、功能缺失验证）构成了完整的转录调控证据链。 * 下游效应机制：Neu_CSP分泌的CCL3和CCL4作为趋化因子，通过作用于乳腺癌细胞表面的受体CCR1，介导了癌细胞的趋化性迁移和侵袭。体内外功能干预实验（抑制CCL3/CCL4、抑制或敲除CCR1）均能有效阻断应激的促转移效应，证实了 “皮质酮-NR3C1-C/EBPβ-CCL3/CCL4-CCR1” 这条信号轴的功能重要性。 5. 临床意义提示：对患者数据的分析表明，CCR1高表达与乳腺癌患者的不良预后相关，特别是与更早的远处转移相关。这为实验室发现提供了临床转化价值和支持，暗示靶向该轴可能具有治疗意义。

五、 研究结论与价值

本研究得出核心结论：慢性心理应激通过激活糖皮质激素受体NR3C1，上调肺转移前微环境中中性粒细胞内的转录因子C/EBPβ，进而驱动其分化为一种新型的、高表达趋化因子CCL3和CCL4的“癌症应激启动中性粒细胞（Neu_CSP）”亚群。该亚群通过分泌CCL3/CCL4，招募表达CCR1的乳腺癌细胞至肺部，从而促进乳腺癌的肺转移。 科学价值：本研究不仅揭示了心理压力影响癌症进展的一条全新机制——“压力-中性粒细胞-癌症”轴，而且首次在肿瘤背景下系统描绘了应激对转移前微环境的单细胞水平重塑，鉴定出具有关键作用的Neu_CSP中性粒细胞亚群。它深化了对免疫细胞可塑性、肿瘤微环境与系统性因素（如神经内分泌应激）互作的理解。 应用价值：研究明确了CCL3/CCL4-CCR1轴是潜在的干预靶点。为此，研究团队不仅验证了使用小分子抑制剂（BX471）或抗体（抗Ly6G）的策略，还创新性地开发了基于细胞类型特异性CRISPR/Cas9的脂质纳米粒递送系统，实现了在体内对特定免疫细胞亚群基因的精准干预，为未来的靶向治疗提供了新的技术思路和候选策略。

六、 研究亮点

1. 创新性的发现：首次鉴定并命名了“癌症应激启动中性粒细胞（Neu_CSP）”这一在应激下产生的功能特异性中性粒细胞亚群，并将其作为连接心理压力与乳腺癌转移的核心桥梁。
2. 系统性的方法：结合了复杂的动物行为模型、先进的单细胞转录组学、体内外多层次的功能验证（包括细胞清除、条件性基因敲除/敲低）、以及临床数据分析，构成了从现象到机制再到临床意义的完整证据体系。
3. 技术方法的创新：自主开发了基于 HMRP8启动子 和 CRISPR/Cas9 的脂质纳米粒递送系统，实现了在活体动物中对中性粒细胞基因（Ccl3/*Ccl4*）的条件性敲除，这是一项具有转化潜力的技术亮点。
4. 机制的深度解析：从系统水平（微环境重塑）到细胞水平（中性粒细胞亚型转换），再到分子水平（皮质酮-C/EBPβ-CCL3/CCL4-CCR1信号轴），对机制进行了逐层深入、逻辑严密的阐释。
5. 强大的临床关联：将基础研究发现的关键分子CCR1与乳腺癌患者的生存预后直接关联，提升了研究发现的转化医学意义。

七、 其他有价值内容

研究还附带揭示了应激对其他免疫细胞和微环境成分的影响，例如：应激降低了肺部T细胞的比例并抑制了其增殖、活化和杀伤功能相关通路；增加了调节性T细胞（Treg）；改变了髓系细胞组成，并可能通过下调树突状细胞（DC）的MHC II类复合物相关基因来抑制抗原呈递功能；同时，应激虽然增加了内皮细胞数量，但下调了紧密连接蛋白基因表达，可能削弱了内皮屏障功能，这为癌细胞外渗提供了有利条件。这些发现共同描绘了一幅应激导致的免疫抑制性和促转移性肺微环境的全景图，丰富了人们对压力影响肿瘤转移多维度机制的认识。