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基于荧光光谱与化学计量学的百合产地快速溯源技术研究报告

一、 研究作者、机构与发表信息 本研究由湖南大学化学化工学院、化学生物传感与计量学国家重点实验室的方鑫、陈增萍、唐章奉、俞汝勤，以及湖南工业大学生命科学与化学学院、生物医用纳米材料与器件湖南省重点实验室的陈瑶共同完成。研究成果以《基于荧光光谱和化学计量学方法的百合产地快速溯源技术》为题，发表于《分析化学（Chinese Journal of Analytical Chemistry）》2023年第51卷第10期（2023年10月），文章页码为1668至1677页，DOI号为10.19756/j.issn.0253-3820.221284。

二、 研究学术背景 本研究属于分析化学与食品/中药材质量安全控制交叉领域，具体涉及光谱分析与化学计量学（Chemometrics）的应用。研究的现实背景是：百合作为一种具有多种药理作用的中药材，其品质（即“道地性”）与产地密切相关。市场上存在以次充好、以其他产区百合冒充道地百合（如“龙牙百合”）牟利的现象，因此迫切需要发展一种快速、准确、操作简便的百合产地鉴别技术。

现有的溯源方法存在各自的局限性：近红外光谱法特异性较差，分类准确率不高；而原子吸收光谱、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等方法虽然准确，但依赖大型仪器、需要复杂的样品前处理（如消解）、消耗特殊气体、成本高且不适合现场快速检测。相比之下，荧光光谱技术具有仪器相对轻便、检测速度快、灵敏度高、成本低的优势。百合本身富含多种内源性荧光物质（如黄酮类、酚酸类、生物碱类、芳香氨基酸等），这为利用荧光光谱进行鉴别提供了物质基础。然而，以往基于荧光光谱的中药材研究多使用提取液，其制备仍需使用有机溶剂并涉及超声、离心等步骤。

基于此，本研究旨在探索一种更为绿色、快速、无损的检测新策略：直接利用百合固体粉末的荧光光谱，结合化学计量学方法，建立百合产地的判别模型。研究的目标是验证该方法的可行性、可靠性，并与基于提取液荧光光谱的传统方法进行比较，以期开发出一种适合于现场、大批量百合样品质量监控的溯源技术。

三、 详细研究流程 本研究流程清晰，主要包含以下几个步骤：样品采集与前处理、光谱数据采集、数据分析与模型构建、方法对比与验证。

1. 样品采集与前处理： 研究团队实地采集了来自四个不同产地的共60份百合鳞茎样品，具体为：湖南平江（24份，品种为一年生龙牙百合）、湖南株洲（13份，品种未知）、湖南龙山（12份，品种为龙雨百合）、江西万载（11份，品种为龙牙百合）。所有样品经过统一的标准化前处理：流水清洗后掰成单片，在100℃沸水中烫片5分钟以灭酶，沥干后于60℃热风烘干，随后粉碎并过80目筛（孔径0.18 mm），得到均匀的百合细粉，直接用于固体荧光光谱测量。

为了进行方法对比，研究还平行制备了百合乙醇提取液样品：称取25 mg百合粉末，加入1 mL 60% (v/v)乙醇溶液，超声提取30分钟，然后以4000 r/min离心10分钟，取上清液用乙醇稀释10倍后，用于三维荧光光谱测量。

2. 光谱数据采集： * 固体粉末荧光光谱：使用FS5荧光光谱仪进行测量。将粉末平铺于载玻片凹槽并加盖玻片固定。经过条件优化，最终确定激发波长为280 nm（此波长下可有效避免固体散射产生的尖锐干扰峰），扫描发射光谱范围300-700 nm，并使用滤光片进一步减少散射光影响。每个样本通过转动载玻片角度重复测量3次，以增加代表性。 * 提取液三维荧光光谱：使用F-7000荧光分光光度计进行测量。激发波长范围200-500 nm，发射波长范围250-600 nm，波长间隔2 nm，获取激发-发射矩阵（EEM）数据。数据处理时，先扣除空白溶剂（60%乙醇）的平均光谱以消除拉曼散射影响，再采用插值法扣除瑞利散射峰，得到可用于分析的三维荧光光谱数据。

3. 数据分析与模型构建： 本研究采用了两种经典的化学计量学模式识别方法构建判别模型：主成分分析-线性判别分析（PCA-LDA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。 * 数据划分：将60个样本（无论是粉末光谱数据还是提取液光谱数据）随机划分为训练集（40个样本）、验证集（15个样本）和测试集（5个样本）。训练集用于构建模型，验证集用于优化模型参数（如主成分数或潜变量数），测试集用于最终评估模型的预测能力。 * 模型构建与评估：基于训练集的荧光光谱数据（粉末的单发射光谱或提取液的三维光谱）及其对应的产地标签，分别建立PCA-LDA和PLS-DA判别模型。模型的关键参数（PCA-LDA的主成分数和PLS-DA的潜变量数）通过留一交互验证法，以模型在验证集上达到最高分类准确率为原则进行确定。对于粉末样品，判别规则为：同一样本3次测量中，有2次及以上被模型判别为同一产地，即视为判别正确。 * 性能指标：采用分类准确率（CCR）、特异性（Specificity）和灵敏度（Sensitivity）三个指标全面评估模型的性能。CCR反映整体正确分类的百分比；特异性反映模型正确拒绝非目标类别样本的能力；灵敏度反映模型正确识别目标类别样本的能力。

四、 主要研究结果 1. 百合粉末荧光光谱特征分析： 在优化条件（激发波长280 nm）下，获得了四个产地百合粉末的荧光发射光谱。结果显示，不同产地样品的光谱形状相似度较高（两两间相似系数在0.8080至0.9601之间），肉眼难以区分，这凸显了借助化学计量学进行模式识别的必要性。然而，光谱的强度及最强荧光峰位置存在可测量的差异。例如，平江百合的最强峰在340-470 nm范围，而龙山和株洲百合的在400-470 nm范围。结合文献中已知荧光物质的发射波长（如原儿茶酸约340 nm，咖啡酸、阿魏酸、盐酸小檗碱约400 nm），研究者推断不同产地百合中主要荧光物质的种类相似，但含量存在差异，这为基于荧光光谱的产地溯源提供了化学依据。

2. 基于粉末荧光光谱的产地判别结果： PCA-LDA和PLS-DA模型均表现出优异的判别性能。 * PCA-LDA模型：确定最佳主成分数为7。该模型对训练集和测试集（验证集）的总体分类准确率（CCR）分别达到93.3%和95.6%。除训练集中对万载和平江样本的灵敏度分别为87.5%和92.9%外，对其他产地样本的灵敏度和特异性均达到或接近100%。 * PLS-DA模型：确定最佳潜变量数为7。该模型性能略优，对训练集的CCR高达98.3%，对测试集为93.3%。训练集和测试集中所有样本的特异性和灵敏度均为100%（测试集总体CCR因样本数少而略有波动）。 * 混淆矩阵分析：PCA-LDA在训练集中将1个万载样本误判为龙山，1个平江样本误判为万载。PLS-DA对训练集的分类全部正确。两个模型对仅由平江样本构成的独立测试集均能100%正确预测。值得注意的是，平江（龙牙百合）与万载（龙牙百合）的样本之间存在一定混淆，研究者分析这可能是因为品种相同对荧光成分含量的影响大于产地不同的影响，这从另一个角度说明了该方法的灵敏性。PLS-DA得分图也直观显示，株洲、龙山、平江样本聚类明显，而万载样本分布较散且与平江样本有部分重叠。

3. 基于提取液三维荧光光谱的产地判别结果（对比实验）： 作为对比，基于百合提取液三维荧光光谱也构建了判别模型。 * PCA-LDA模型（9主成分）对训练集和测试集的CCR分别为97.5%和100%。 * PLS-DA模型（9潜变量）对训练集CCR为100%，对测试集为93.3%。 两个模型对平江样本的判别灵敏度略低于其他产地，但总体性能同样出色。混淆矩阵显示，PCA-LDA在训练集中误判1个平江样本为龙山，PLS-DA在测试集中误判1个平江样本为株洲。

4. 核心对比结论： 统计分析表明，基于百合粉末荧光光谱的判别结果与基于百合提取液三维荧光光谱的判别结果无显著性差异。这意味着，跳过繁琐的提取步骤，直接使用固体粉末进行检测，可以达到与经典液相检测方法相当的溯源精度。

五、 研究结论与价值 本研究成功开发并验证了一种基于百合固体粉末荧光光谱结合化学计量学（PCA-LDA, PLS-DA）的快速产地溯源新技术。主要结论如下： 1. 技术可行性：该方法能够准确区分湖南平江、株洲、龙山和江西万载四个产地的百合，判别模型准确率高（CCR >93%），可靠性强。 2. 方法优势：与需要复杂前处理的提取液荧光法相比，粉末直接检测法在保证溯源精度的前提下，操作极为简单（仅需粉碎）、检测速度快、完全无需使用有机溶剂、样品无损（粉末可回收），是一种绿色环保的检测方法。 3. 应用价值：该方法特别适合于市场监管部门、企业质控实验室进行现场、大批量百合样品的快速筛查与产地鉴别，为打击以次充好、维护“道地药材”市场秩序和消费者权益提供了一种强有力的技术工具。 4. 科学价值：研究证实了直接利用中药材固体粉末的荧光“指纹”信息进行产地溯源的可行性，为其他具有内源性荧光成分的中药材或农产品的快速质量评价提供了新的研究思路和技术路径。

六、 研究亮点 1. 方法创新性：首次将固体粉末直接荧光检测应用于百合的产地溯源，摒弃了传统的溶剂提取步骤，极大简化了操作流程，实现了真正意义上的“快速”与“绿色”检测。 2. 研究设计的严谨性：研究不仅建立了粉末检测法，还设置了与成熟的提取液三维荧光光谱法的对比实验，通过数据有力地证明了新方法与传统方法等效，增强了结论的说服力。 3. 问题剖析深入：对模型误判情况（如平江与万载样本混淆）进行了合理解释（归因于品种相同），体现了对数据背后化学与生物学原因的深入思考，而非单纯追求模型指标。 4. 技术实用性强：整个方法链（样品处理-光谱采集-数据分析）清晰、标准化，所选用的化学计量学模型成熟稳定，易于在实际应用中推广和实现。

七、 其他有价值内容 研究中对实验条件的细致优化体现了科学工作的严谨性。例如，通过比较不同激发波长（250, 260, 270, 280 nm）下的粉末荧光光谱，发现280 nm能有效避免固体散射干扰，从而选择了该波长作为最佳激发条件。这种对基础测量条件的优化是保证后续数据质量和模型性能的关键前提，值得在类似研究中借鉴。