北京大学团队在《DNA Repair》发表新型基因组DNA无碱基位点均相荧光检测方法

2023年1月13日，北京大学化学与分子工程学院赵美萍教授团队在《DNA Repair》期刊（Volume 122, 103451）发表题为”A homogeneous fluorescence assay for rapid and sensitive quantification of the global level of abasic sites in genomic DNA”的研究论文。该研究开发了一种高选择性、高灵敏度的均相荧光检测系统，用于基因组DNA（genomic DNA, gDNA）中无碱基位点（apurinic/apyrimidinic sites, AP sites）的快速定量检测。

研究背景
AP位点是基因组DNA中最常见的损伤类型之一，由碱基自发水解或外源损伤因子（如烷化剂、活性氧等）引发。每天每个细胞可能产生10,000-50,000个AP位点。若未被修复，这些损伤会阻碍DNA复制和转录，导致细胞毒性和突变，与帕金森病、阿尔茨海默病及癌症等多种疾病相关。传统检测方法如醛反应探针（ARP）-ELISA和液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）存在耗时长（>24小时）、样本需求量大（>10 μg）、与5-甲酰胞嘧啶（5-fC）和5-甲酰尿嘧啶（5-fU）交叉反应等问题。因此，开发一种快速、高选择性的均相检测方法具有重要科学意义。

研究方法与流程
1. AP位点的共价标记
- 酶切转化：利用T4嘧啶二聚体糖基化酶（T4 PDG）将AP位点转化为3′-α,β-不饱和醛结构，显著提高反应活性。
- 探针设计：合成5′-羟胺修饰的寡核苷酸链（5′HA-L14），通过点击化学反应引入羟胺基团，经LC-MS验证修饰效率（m/z=4593.1）。
- 选择性验证：在5-fC和5-fU存在的DNA中，5′HA-L14仅与T4 PDG处理的AP位点特异性结合，交叉反应率%。

1. 过量标记链的去除

   • λ外切酶（λ exo）调控：通过辅助链（Y17）与过量5′HA-L14形成5′端2-nt悬垂结构，触发λ exo（300 U/mL）选择性消化，去除效率>95%。
     
   • 优化条件：反应时间30分钟，Y17浓度8 nM，避免后续信号检测干扰。

2. 信号放大与检测

   • 荧光探针设计：采用5′-FAM标记的P1-AT探针，与标记的AP-L14形成2-nt悬垂结构，在λ exo（250 U/mL）作用下释放荧光信号。
     
   • 灵敏度测试：线性范围5 pM–200 pM，检测限低至0.2 fmol，仅需≤500 ng gDNA输入。

3. 细胞实验验证

   • 样本处理：用甲基甲磺酸酯（MMS）和叔丁基过氧化氢（t-BHP）处理Hela、A549和MCF-7细胞，提取gDNA并片段化。
     
   • 损伤与修复监测：MMS和t-BHP分别诱导AP位点增加5.9–12.3倍，修复18小时后降低30–50%。

主要结果
- 高选择性：5′HA-L14对5-fC和5-fU的区分能力显著优于传统ARP探针。
- 均相检测优势：无需分离纯化步骤，总检测时间缩短至5小时。
- 细胞应用：成功量化不同处理条件下细胞中AP位点的动态变化，如MCF-7细胞在20 mM MMS处理后AP位点达基线6.1倍。

结论与价值
该研究首次将T4 PDG介导的AP位点转化与λ exo驱动的信号放大相结合，建立了迄今最灵敏的AP位点均相检测方法。其科学价值体现在：
1. 为DNA损伤修复研究提供了高精度工具；
2. 通过终端碱基对调控λ exo活性，拓展了酶学应用场景；
3. 可适配其他糖基化酶，用于多种DNA损伤的检测。

研究亮点
- 方法学创新：首次利用T4 PDG增强AP位点标记效率，结合λ exo的序列特异性消化，实现”标记-清除-检测”一体化。
- 应用潜力：适用于临床样本中DNA损伤的生物标志物筛查，为癌症和神经退行性疾病的机制研究提供新思路。

其他价值
- 提出的λ exo/辅助链系统可推广至其他核酸混合物的选择性清除，如循环肿瘤DNA中低频突变的检测。
- 研究获中国国家自然科学基金（22174005、21974005）支持，相关数据可通过通讯作者申请获取。

（注：全文实验数据及辅助链序列详见论文Supplementary Material）