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CRISPR体内筛选揭示营养信号调控CD8+ T细胞命运决定机制

一、研究团队与发表信息
本研究由美国圣裘德儿童研究医院（St. Jude Children’s Research Hospital）的Hongling Huang、Peipei Zhou、Jun Wei等共同完成，通讯作者为Hongbo Chi。研究成果于2021年3月4日发表在《Cell》期刊（Volume 184, Issue 6），标题为《In vivo CRISPR screening reveals nutrient signaling processes underpinning CD8+ T cell fate decisions》。

二、学术背景
CD8+ T细胞在适应性免疫中通过分化为效应T细胞（Teff）和记忆T细胞（Tmem）发挥关键作用。然而，早期事件如何调控Tmem的生成和质量仍不完全清楚。代谢重编程已被证明影响T细胞分化，但多数研究基于体外实验，体内代谢调控网络尚待系统解析。本研究旨在通过体内CRISPR筛选，揭示代谢通路对CD8+ T细胞命运决定的调控机制，并为增强抗感染和抗肿瘤免疫提供新靶点。

三、研究流程与方法
1. 体内CRISPR筛选系统构建
- 研究对象：使用表达Cas9和LCMV特异性TCR（P14转基因）的CD8+ T细胞，感染淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）Armstrong株。
- 文库设计：针对3,017个代谢相关基因的向导RNA（gRNA）文库，通过慢病毒转导至T细胞。
- 筛选策略：比较记忆前体细胞（MP, Klrg1−CD127+）与终末效应细胞（TE, Klrg1+CD127−）中gRNA的富集情况，鉴定调控Tmem生成的负向调节因子。

1. 验证实验

   • 双色转移系统：将非靶向对照（sgNTC, GFP+）和靶基因gRNA（Ametrine+）转导的T细胞按1:1比例混合，移植至同一宿主，验证筛选结果。
     
   • 基因编辑效率：通过测序确认靶基因敲除效率（73%-96%）。
     
   • 功能分析：检测细胞表型（CXCR3hiCD27hi、CD62L+）、凋亡（caspase-3）、代谢活性（Mitotracker、TMRE）等。
     

2. 机制研究

   • 氨基酸转运体功能：发现Slc7a1（精氨酸转运体）和Slc38a2（谷氨酰胺转运体）通过激活mTORC1信号限制Tmem生成。
     
   • Pofut1-Notch轴：蛋白-O-岩藻糖基转移酶1（Pofut1）通过GDP-岩藻糖依赖性Notch-RBPJ信号促进终末效应细胞（TE0）分化。
     
   • 单细胞RNA测序（scRNA-seq）：揭示Teff异质性，鉴定中间态Tint细胞（CXCR3hiCD127lo）及其向TE0分化的轨迹。
     

3. 数据分析

   • 转录组与表观组：通过RNA-seq、ATAC-seq分析染色质开放性和转录因子结合（如AP-1家族）。
     
   • 代谢通量：Seahorse检测线粒体氧化磷酸化（OCR）和糖酵解（ECAR）。
     

四、主要结果
1. 氨基酸转运体调控Tmem数量
- Slc7a1或Slc38a2敲除显著增加MP/TE比例（p<0.01），并增强Tmem的长期存续（图2a-2e）。
- 机制上，二者通过促进mTORC1信号（磷酸化S6水平升高）抑制记忆分化（图2f-2g）。

1. Pofut1缺失同时增强Teff和Tmem功能

   • Pofut1敲除减少TE0细胞（Klrg1hiCXCR3lo），但增加中间态Tint细胞（图4j），伴随代谢活性（OCR、ECAR）和增殖（BrdU+）提升（图5f-5h）。
     
   • 在肿瘤模型（B16-OVA）中，Pofut1缺陷的OT-1细胞显著提升抗肿瘤效果（图3l-3m）。
     

2. Notch信号驱动终末分化

   • Pofut1依赖其岩藻糖基转移酶活性，通过Notch-RBPJ轴促进TE0分化（图6a-6k）。过表达Notch细胞内域（NICD）可挽救Pofut1缺失的表型（图7i-7j）。
     

五、结论与意义
本研究首次通过体内CRISPR筛选系统解析了营养信号（氨基酸、GDP-岩藻糖）调控CD8+ T细胞命运的分子网络：
1. 科学价值：揭示了代谢异质性如何决定Teff亚群（Tint→TE0）的分化轨迹，提出Notch信号在终末分化中的上下文依赖性作用。
2. 应用潜力：靶向Slc7a1、Pofut1等分子可优化Tmem的“数量”与“质量”，为感染和肿瘤免疫治疗提供新策略。

六、研究亮点
1. 技术创新：开发了基于体内CRISPR筛选的代谢调控研究范式，整合scRNA-seq和ATAC-seq多组学分析。
2. 概念突破：发现Tint细胞作为Teff可塑性的关键中间态，并阐明Pofut1-Notch轴对其分化的调控。
3. 跨模型验证：在LCMV感染、李斯特菌模型（LM-OVA）和黑色素瘤模型中均证实靶标分子的普适性功能。

七、其他价值
研究还发现Pofut1依赖性与癌症患者免疫治疗响应负相关（未发表数据），提示其临床转化潜力。数据已通过TCGA和公共数据集进行生物信息学验证。

（注：全文约2000字，涵盖研究全流程，重点突出机制解析与多模型验证的逻辑链条。）