本研究由Kimio Isomura、Masatsugu Chikahira、Kiyoshi Teranishi和Kokichi Hamada共同完成，作者单位均为日本兵库县公共卫生研究所（Public Health Institute of Hyogo Prefecture）。研究成果发表于1984年的《Mutation Research》期刊（Volume 136, Pages 119-125），标题为《Induction of mutations and chromosome aberrations in lung cells following in vivo exposure of rats to nitrogen oxides》。
学术背景
氮氧化物（NOx）是城市光化学烟雾的主要氧化剂之一，但相较于臭氧等其他氧化剂，其遗传毒性研究较为匮乏。尽管已有报道显示二氧化氮（NO₂）在体内具有细胞毒性（Hine et al., 1970），且体外实验证实NO₂可诱导中国仓鼠细胞染色体畸变（Tsuda et al., 1981），但关于NOx在体内直接诱导肺细胞突变和染色体损伤的系统研究仍属空白。本研究旨在通过大鼠体内暴露实验，明确NO₂和一氧化氮（NO）对肺细胞的致突变性和染色体畸变诱导能力，为评估环境NOx污染的健康风险提供实验依据。
研究流程
气体暴露实验
- 对象与条件：选用3周龄雄性Sprague-Dawley大鼠（每组5只），在不锈钢暴露舱（0.35 m³）中分别暴露于NO₂（8–27 ppm）或NO（9–27 ppm）3小时，对照组暴露于过滤空气。气体浓度通过Saltzman法（1954）实时监测，NO浓度通过高锰酸钾氧化为NO₂后测定。
- 特殊处理：NO暴露前经颗粒状碱石灰净化，确保舱内NO₂/NO比例低于0.05，以排除NO₂干扰。
肺细胞分离与培养
- 细胞提取：暴露后18小时处死大鼠，肺组织经胶原酶（Type I, Sigma）消化40分钟，过滤后离心获取细胞。
- 原代培养：细胞悬液接种于含10%胎牛血清的A-medium（Flow Laboratories），37°C、5% CO₂培养5天，期间换液两次。
突变频率检测
- 细胞存活率：以200个细胞/皿接种，7天后吉姆萨染色计数集落形成率（Plating Efficiency, PE）。
- 抗乌本苷（ouabain）突变筛选：2×10⁵细胞/皿培养5小时后，加入1 mM乌本苷（选择浓度通过剂量响应曲线确定），14天后计数抗性集落，计算每10⁵存活细胞的突变频率。
染色体畸变分析
- 中期相制备：培养3天后加入秋水仙胺（0.05 μg/mL）阻滞分裂，低渗处理后固定，吉姆萨染色。
- 畸变类型统计：每剂量组分析450–550个中期相，记录染色单体断裂（chromatid breaks）、染色体断裂（chromosome breaks）及交换（exchanges）等畸变类型。
主要结果
突变诱导
- NO₂效应：15–27 ppm NO₂显著增加抗乌本苷突变频率（21倍于对照组，p<0.05），且呈剂量依赖性（表1）。
- NO效应：仅27 ppm NO诱导突变频率显著升高（9.5×10⁻⁵ vs 对照组2.6×10⁻⁵），低浓度无显著差异。
染色体畸变
- NO₂暴露后，染色单体断裂率显著增加（8 ppm和27 ppm分别为对照组的2.5倍和12倍），且畸变以染色单体型为主（表2）。NO未检测到显著畸变诱导。
机制关联性
- 既往细菌实验（TA100菌株）显示NO₂在2–10 ppm即可诱导碱基置换突变（图3a），而NO需超过20 ppm才表现微弱活性（图3b），与体内结果一致。
- 染色体畸变在多次细胞分裂后仍持续存在，提示NO₂可能通过脂质过氧化产生的烷氧自由基（RO·）导致DNA烷基化损伤（Menzel, 1980），且修复效率低下。
结论与价值
本研究首次证实NO₂和NO在体内可直接诱导肺细胞基因突变和染色体畸变，其中NO₂的遗传毒性更强。科学价值在于：
1. 机制拓展：提出NO₂可能通过自由基链式反应损伤DNA，为氧化性气体遗传毒性机制提供新视角。
2. 方法创新：建立大鼠肺细胞原代培养模型，克服淋巴细胞受血液成分干扰的局限，更准确反映气体对靶器官的直接影响。
3. 应用意义：为制定环境NOx暴露限值提供实验依据，提示需关注长期低浓度暴露的潜在致癌风险。
研究亮点
- 关键发现：明确NO₂在15 ppm以上即具显著致突变性，且染色单体断裂为其主要畸变类型。
- 技术特色：结合体内暴露与原代细胞分析，创新性采用乌本苷抗性筛选体系（灵敏度达10⁻⁵）。
- 跨模型验证：通过细菌、仓鼠细胞与大鼠实验的多层次数据，强化结论可靠性。
其他要点
研究受日本文部科学省资助（1978年），部分实验方法参考了Grover（1962）的肺细胞分离流程，但优化了培养条件以提高细胞存活率。作者建议后续研究应探讨SO₂等混合气体的协同效应（Ma et al., 1973）。