本文由南开大学化学学院分析科学研究中心、天津生物传感与分子识别重点实验室、国家药化生物重点实验室的杜奕晨（Yi-chen Du）、王思源（Si-yuan Wang）、李小玉（Xiao-yu Li）、王雅欣（Ya-xin Wang）、唐安娜（An-na Tang）以及通讯作者孔德明（De-ming Kong）教授团队完成，于2019年发表在期刊《Biosensors and Bioelectronics》上。
本研究属于生物传感与分析化学领域，聚焦于开发高灵敏度、高特异性的生物分子检测方法。脱氧核糖核酸（DNA）甲基转移酶（Methyltransferase， MTase）和聚核苷酸激酶（Polynucleotide Kinase， PNK）是两种重要的DNA依赖酶，分别调控DNA甲基化和DNA修复过程。它们的活性异常与多种人类疾病，特别是癌症的发生发展密切相关。因此，精确检测这两种酶的活性对于基础生化研究、疾病诊断和药物发现具有重大意义。传统的检测方法，如高效液相色谱（HPLC）、凝胶电泳、放射性分析和免疫化学方法，普遍存在操作复杂、仪器昂贵、灵敏度低或使用危险放射性物质等局限性。近年来，基于比色法、电化学法、化学发光法和荧光法等新方法虽有所发展，但许多仍依赖于模板依赖的DNA聚合反应，存在探针设计复杂、背景信号高的问题。因此，开发一种简单、灵敏且特异性强的检测新策略显得尤为迫切。本研究的目的是构建一种通用的、高灵敏的信号放大策略，用于检测DNA甲基转移酶（特别是Dam MTase）和PNK的活性，并验证其在复杂生物样本中的应用潜力，包括抑制剂筛选和细胞裂解液中的酶活性分析。
研究工作的核心是设计并验证一种名为“末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TDT）激活的切口酶扩增反应（TDT-NEAR）”的传感策略。该研究包含两大主要实验流程：分别针对Dam MTase和T4 PNK的检测。
针对Dam MTase活性检测的工作流程如下： 首先，研究人员设计并制备了一个关键的前体底物——一个封闭的哑铃型DNA寡核苷酸（esDam）。其对称茎区含有Dam MTase的识别位点（5’-GATC-3’）和一个不完整的切口酶Nt.BbvCI识别序列（5’-GCTGA-3’）。该底物通过一条5‘-磷酸化的线性DNA（sDam）自模板连接而成，并使用外切酶（Exo I/III）消化未反应的线性底物以纯化。 其次，建立检测体系。第一步是甲基化/切割反应：在含有esDam底物的溶液中，加入待测的Dam MTase及其辅因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM），以及内切酶Dpn I。Dam MTase催化esDam茎区特定腺嘌呤发生甲基化，随后Dpn I能够特异性切割甲基化的序列，将完整的哑铃结构切割成两个发夹状片段，每个片段都暴露出一个游离的3‘-羟基（3’-OH）末端。 第二步是TDT介导的延伸反应：向上述反应产物中加入TDT和单一脱氧核苷酸dGTP。TDT是一种模板非依赖的DNA聚合酶，它能在暴露的3‘-OH末端连续添加dGTP，形成多聚鸟嘌呤（Poly(G)）序列。这一延伸过程的关键在于，它将底物中原本不完整的Nt.BbvCI识别序列（5’-GCTGA-3‘）补全为完整的识别序列（5’-GCTGA-加上延伸出的G序列，形成完整位点如5‘-GCTGA(G)n…，其中延伸出的G序列与互补链配对后构成了完整的酶切位点）。 第三步是切口酶介导的循环信号放大：反应混合物经过加热灭活TDT后，加入一个两端分别标记了荧光基团（FAM）和淬灭基团（BHQ1）的报告探针（F-Q probe），以及切口酶Nt.BbvCI。此时，带有完整Nt.BbvCI识别序列的TDT延伸产物（即发夹结构被打开后的双链形式）能够与F-Q探针杂交。Nt.BbvCI会切割杂交双链中特定的链，将F-Q探针切断，导致荧光基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。关键的是，切割后，靶标DNA序列被释放出来，可以继续与新的F-Q探针结合并启动新一轮的切割，形成循环扩增，从而将一个酶活性事件转化为大量荧光信号，实现信号的高倍数放大。 在整个流程中，除了常规的终点荧光光谱检测（激发波长492 nm，发射波长517 nm），研究者还采用了实时荧光监测模式，使用实时定量PCR仪同步记录Nt.BbvCI催化信号放大过程中的荧光变化，以简化操作并实现高通量检测。 数据分析和优化方面，研究通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证了每一步反应（甲基化切割、TDT延伸）的发生。通过优化esDam浓度、Dpn I用量、TDT用量以及各步反应时间等条件，获得了最佳检测性能。灵敏度通过测量不同浓度Dam MTase下的荧光强度来评估，并绘制标准曲线。特异性通过测试其他酶（如M.SssI MTase）和蛋白质（如牛血清白蛋白BSA）的响应来验证。应用潜力则通过在人血清样本中添加已知浓度的Dam MTase进行加标回收实验，以及使用已知抑制剂5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil）进行抑制实验来评估。
针对T4 PNK活性检测的工作流程如下： 该平台旨在展示TDT-NEAR策略的通用性。其设计更为简洁，使用了一个3‘-末端磷酸化的线性底物（sPNK），该底物同样含有一个不完整的Nt.BbvCI识别序列。其工作原理与Dam MTase检测类似但步骤更少：PNK的主要功能之一是催化核酸3‘-磷酸末端的去磷酸化，生成3’-OH末端。当存在PNK时，sPNK的3‘-磷酸基团被移除，暴露出3’-OH。随后，在TDT和dGTP存在下，从该3‘-OH末端开始延伸Poly(G)序列，从而形成完整的Nt.BbvCI识别位点。后续的步骤与Dam MTase检测完全相同：延伸产物触发Nt.BbvCI介导的F-Q探针循环切割与荧光信号放大。实验流程包括PNK去磷酸化与TDT延伸的合并反应，然后灭活TDT，最后加入Nt.BbvCI和F-Q探针进行信号放大与检测。同样，研究者评估了该方法的灵敏度、特异性，并使用已知抑制剂硫酸铵（(NH4)2SO4）进行了抑制实验。此外，还成功将方法应用于检测人宫颈癌细胞系（HeLa）裂解液中的内源性PNK活性。
研究的主要结果详实且有力地支撑了研究结论。首先，PAGE分析（图1a）直观证实了esDam被Dam MTase/Dpn I成功切割，并且切割产物能在TDT催化下发生延伸。荧光动力学实验（图1b）证明，人工合成的模拟延伸产物（MP）能够高效触发Nt.BbvCI的循环切割，产生显著的荧光增强，且MP可重复使用（不同MP浓度下最终达到相似的荧光平台值），而esDam本身则不能，这验证了信号放大机制的关键步骤。可行性验证（图1c）表明，只有在所有必需组分（Dam MTase, esDam, Dpn I, TDT, dGTP, Nt.BbvCI）齐全时，才能观察到显著的荧光信号，缺失任一关键组分均无响应，证明了设计的特异性。特别重要的是，实验（图1d）表明，即使系统中存在带有3‘-OH末端的随机DNA序列，TDT会对其延伸，但由于这些延伸产物不含有完整的Nt.BbvCI识别位点，无法触发后续的信号放大，因此不会导致明显的背景荧光升高。这一结果凸显了该策略独特的“双保险”抗干扰能力：不仅需要TDT延伸，还需要延伸形成特定的功能序列（完整切口酶位点）才能产生信号。 在优化条件下，该方法对Dam MTase表现出优异的灵敏度（图2a, b）。荧光强度与Dam MTase浓度在0.01至4 U/mL范围内呈良好线性关系，检测限低至0.002 U/mL，优于或相当于许多已报道的方法。实时检测模式（图2c, d, e）进一步拓展了方法的实用性，能够更清晰地区分低浓度样品与空白对照，且操作更简便、自动化程度更高。特异性测试（图2f）显示，只有Dam MTase能引起强荧光响应，而同为甲基转移酶的M.SssI MTase或非特异性蛋白BSA均无响应，表明方法对Dam MTase具有高度选择性。在人血清样本中的加标回收实验（表2）获得了98.72%至105.1%的回收率，证明了该方法在复杂生物基质中准确检测的潜力。在抑制剂筛选方面，研究表明5-氟尿嘧啶对体系中的其他酶（Dpn I, TDT, Nt.BbvCI）活性无影响，其抑制Dam MTase活性的半数抑制浓度（IC50）值为0.86 μM，与文献报道一致，验证了该方法可用于抑制剂效能评估。 对于T4 PNK的检测，结果同样成功。荧光验证实验（图4b）证实了设计的可行性。该方法对PNK的检测灵敏度高，在0.001至0.05 U/mL范围内线性良好，检测限为4×10^-4 U/mL（图4c）。使用硫酸铵作为模型抑制剂，测得其IC50值为12.42 mM（图4d），与文献值接近。最突出的应用成果是，该方法成功用于检测HeLa细胞裂解液中的PNK活性（图4e, f）。实验表明，荧光增强确实来源于细胞中活性PNK的作用（加热灭活或加入抑制剂后信号大幅减弱），并估算出每个HeLa细胞中约含有2.3×10^-4 U的PNK活性，与已有报道相符。
本研究的结论是，成功开发了一种基于TDT-NEAR原理的新型生物传感策略，用于高灵敏度、高特异性地检测Dam MTase和T4 PNK的活性。该方法对两种酶的检测限分别达到0.002 U/mL和4×10^-4 U/mL，其高性能得益于Nt.BbvCI催化的高效循环信号放大。该策略的核心创新在于其独特的工作机制：通过TDT催化的模板非依赖延伸，将酶促反应事件（甲基化/去磷酸化）转化为特定功能序列（完整的切口酶识别位点）的生成，从而启动后续的循环切割放大。这一机制巧妙地规避了传统TDT传感器易受样本中其他核酸干扰而产生高背景的固有缺陷，显著提升了方法的抗干扰能力和在真实复杂生物样本（如人血清、细胞裂解液）中的应用可靠性。此外，研究还证明了该平台在酶抑制剂筛选和抑制效能定量评估方面的有效应用。
本研究的亮点在于：第一，提出并验证了一种新颖的、通用的信号放大策略（TDT-NEAR），将TDT的序列非依赖性延伸与切口酶的循环切割能力相结合，实现了信号的高效放大。第二，该方法具有出色的灵敏度和特异性，检测限低。第三，独特的“功能序列生成”机制赋予了方法强大的抗背景干扰能力，这是相对于许多其他TDT基传感器的关键优势。第四，展示了良好的通用性，通过更换简单的底物设计，即可将同一核心策略应用于两种功能不同的酶（MTase和PNK）的检测。第五，成功实现了在复杂生物样本（人血清）和实际生物体系（癌细胞裂解液）中的精准检测，并证明了其在药物筛选（抑制剂评估）方面的实用价值，为生物医学研究和临床诊断提供了有力的新工具。
其他有价值的内容包括：研究者对实验条件进行了系统优化；采用了终点和实时两种检测模式，增加了方法的灵活性；通过详尽的对照实验排除了潜在干扰因素（如抑制剂对其他酶的影响）；为相关领域的研究者提供了一个基于核酸信号放大的新范式。该工作由国家自然科学基金和南开大学中央高校基本科研业务费资助。