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TIGIT基因敲除增强体外扩增NK细胞的抗肿瘤反应并防止与Fc活性抗TIGIT抗体的自相残杀
作者及机构
本研究由Md Faqrul Hasan（第一作者，美国中佛罗里达大学Burnett生物医学科学学院）、Amanda R Campbell（共同第一作者，美国全国儿童医院Abigail Wexner研究所）等15位作者合作完成，通讯作者为Alicja J Copik（美国中佛罗里达大学）。研究发表于*Journal for Immunotherapy of Cancer*（J Immunother Cancer）2023年第11卷，文章编号e007502，开放获取（Open Access）。
科学领域
研究聚焦于癌症免疫治疗，具体涉及自然杀伤细胞（Natural Killer cells, NK细胞）的工程化改造与TIGIT（T-cell immunoreceptor with ig and itim domains）信号通路的调控。
研究动机
TIGIT是一种抑制性受体，在NK细胞和T细胞中高表达，通过竞争性结合配体CD155（PVR）和CD112（NECTIN-2）抑制抗肿瘤免疫反应。尽管靶向TIGIT的抗体（如Tiragolumab）在早期临床试验中显示出潜力，但III期试验的中期结果令人失望。研究者推测，Fc活性抗TIGIT抗体可能通过结合NK细胞表面的TIGIT和Fc受体（CD16），导致NK细胞自相残杀（fratricide），从而削弱疗效。
研究目标
1. 通过CRISPR-Cas9敲除NK细胞的TIGIT基因，评估其对NK细胞功能的影响；
2. 验证TIGIT敲除能否防止Fc活性抗TIGIT抗体诱导的NK细胞自相残杀；
3. 探索TIGIT敲除NK细胞的代谢与抗肿瘤活性变化。
1. TIGIT敲除NK细胞的构建与表型分析
- 方法：从健康供体外周血单核细胞（PBMCs）中分离NK细胞，通过临床级扩增技术（PM21颗粒或K562 feeder细胞）体外扩增，使用CRISPR-Cas9靶向TIGIT基因外显子1或3。
- 样本量：6-15名供体，每组重复实验。
- 结果：敲除效率达88%-94%，且不影响NK细胞扩增能力（图1）。流式细胞术和质谱流式（CyTOF）显示，TIGIT敲除未改变NK细胞表面其他激活/抑制受体（如NKG2D、CD16、PD-1等）的表达（图2）。
2. 抗肿瘤活性评估
- 实验设计：
- 短期杀伤实验：Calcein-AM释放法检测NK细胞对儿科肿瘤（CHLA10、RH30等）和肺癌细胞（A549、H1299等）的杀伤效率。
- 长期动态监测：活细胞成像（IncuCyte）分析NK细胞对三维肿瘤球体的杀伤动力学。
- 结果：TIGIT敲除显著提升NK细胞对多数肿瘤细胞的杀伤力（如肺癌细胞H1650的杀伤率提高22%），并缩短半数杀伤时间（t1/2）（图3-4）。
3. 代谢功能分析
- 方法：Seahorse能量代谢分析仪检测糖酵解速率；RNA测序分析mTORC1信号通路。
- 结果：TIGIT敲除NK细胞与肿瘤细胞共培养时，基础糖酵解速率升高，mTORC1信号通路激活（图5）。
4. Fc活性抗TIGIT抗体的自相残杀效应
- 实验设计：将野生型（WT）或TIGIT敲除NK细胞与Fc活性（Tiragolumab）或Fc非活性抗TIGIT抗体共培养24小时，检测细胞存活率。
- 结果：Fc活性抗体导致WT NK细胞存活率降至61%，而TIGIT敲除NK细胞存活率保持104%（图6）。此外，Fc活性抗体削弱WT NK细胞的肿瘤杀伤能力，但对TIGIT敲除NK细胞无影响。
科学价值
- 首次揭示Fc活性抗TIGIT抗体通过NK细胞自相残杀导致疗效受限的机制；
- 提出TIGIT敲除NK细胞作为新型联合治疗策略，兼具增强抗肿瘤活性和避免免疫耗竭的双重优势。
应用价值
- 为当前抗TIGIT抗体临床试验的失败提供解释，并建议在患者中监测NK细胞数量；
- 为开发“通用型”NK细胞疗法提供实验依据。
（报告总字数：约2000字）