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非酒精性脂肪肝病背景下小鼠原位肝肿瘤模型的建立及免疫治疗研究

作者及机构
本研究由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）下属国家癌症研究所（National Cancer Institute）的Zachary J. Brown、Bernd Heinrich和Tim F. Greten合作完成，发表于2018年6月的《Methods and Protocols》期刊（卷1，第21期）。

学术背景
肝癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，2015年死亡病例达81万例。非酒精性脂肪肝病（NAFLD，Non-alcoholic Fatty Liver Disease）及其进展形式非酒精性脂肪性肝炎（NASH）与代谢综合征密切相关，其全球患病率因肥胖和糖尿病流行而迅速上升。NAFLD患者中肝癌发病率显著升高（NASH患者达5.29/1000人年）。既往研究表明，NAFLD通过脂肪酸过度摄入导致CD4+ T细胞选择性缺失，从而影响肿瘤免疫微环境（TME）。为研究NAFLD背景下肝癌的免疫治疗机制，本研究开发了一种快速诱导NAFLD合并原位肝肿瘤的小鼠模型，结合生物发光成像（BLI，Bioluminescent Imaging）技术实现肿瘤生长和治疗反应的动态监测。

研究流程
1. NAFLD/NASH诱导
- 方法：选用6-8周龄B6(Cg)-Tyrc-2J/J白化小鼠（减少BLI背景干扰），喂食缺乏甲硫氨酸和胆碱的饲料（MCD diet）2周。该饮食可在10天内诱导脂肪性肝炎，但无法模拟肥胖和胰岛素抵抗。
- 关键参数：小鼠体重可能减轻30%，需定期监测。肝脏病理显示脂肪变性（H&E染色证实）。

1. 原位肝肿瘤细胞注射

   • 细胞准备：使用表达荧光素酶（luciferase）的RIL-175肝癌细胞系（源自C57BL/6小鼠），以PBS与基质胶（Matrigel）1:1混合悬浮（10^5–10^6细胞/20μl）。基质胶可防止细胞回流并提高成瘤一致性。
     
   • 手术操作：
     
     • 麻醉后，在左腹上缘作1cm横向切口，暴露肝脏左叶。
       
     • 29G针头穿刺肝实质数毫米后缓慢注入肿瘤细胞悬液，形成皮下”轮状”隆起。
       
     • 两层缝合腹膜和皮肤（5-0 Vicryl缝线），术后镇痛并监测恢复。
       
   • 注意事项：需避免黑色皮毛小鼠因背景信号干扰BLI结果；注射后3周为实验终点（总时长5周）。
     

2. 肿瘤生长监测（BLI技术）

   • 成像流程：腹腔注射D-荧光素（150 mg/kg），8分钟后使用Xenogen IVIS系统（CCD相机冷却至-105°C至-110°C）采集图像（曝光30秒，中值分档）。
     
   • 数据校准：需定期剃毛以减少信号衰减；晚期肿瘤可能因坏死导致BLI低估实际负荷。
     

主要结果
1. 模型有效性
- MCD饮食成功诱导肝脏脂肪变性和炎症（图3），与人类NAFLD病理特征部分吻合。
- 原位注射形成单一优势肿瘤结节（图5a），利于分离肿瘤与周围肝组织进行免疫细胞分析。
- BLI显示光子信号随时间递增（图4c），与解剖后肿瘤体积一致（图4b）。

1. 免疫微环境特征

   • 该模型重现了NAFLD导致的CD4+ T细胞缺失现象（引用团队前期Nature论文），为免疫治疗研究提供基础。
     
   • 对比正常肝脏，NAFLD肝脏中肿瘤更易出现肺转移（图5b），提示微环境促进侵袭性。
     

2. 多用途验证

   • 该技术可扩展至其他细胞系（如B16黑色素瘤），证明其普适性。
     

结论与价值
1. 科学价值
- 首次将快速NAFLD诱导与原位肝肿瘤手术模型结合，在4-5周内完成从疾病建模到治疗评估的全流程，显著缩短实验周期。
- 明确NAFLD通过改变TME影响肝癌进展，为靶向CD4+ T细胞的免疫疗法提供实验平台。

1. 应用价值
   
   • BLI动态监测技术可量化治疗响应，适用于化疗、靶向及免疫治疗的临床前评价。
     
   • 单结节肿瘤模型优于遗传工程小鼠的多灶性肝癌，便于精确分离组织进行分子分析。
     

研究亮点
1. 方法创新：
- 优化MCD饮食时间窗（2周）与肿瘤注射的协同性，平衡疾病进展速度和动物福利。
- 开发肝包膜下注射技术，通过基质胶预混提高细胞滞留率（成功率>90%）。

1. 跨学科技术整合：

   • 结合外科手术、分子影像和免疫分析，实现多参数肿瘤微环境研究。
     

2. 局限性：

   • MCD饮食未完全模拟人类代谢综合征的肥胖特征，未来可联合高脂饮食（HFD）优化模型。
     

其他价值
本研究建立的标准化操作流程（SOP）已被用于NIH多项免疫治疗课题，相关技术细节（如缝合方法、BLI参数设置）为同类研究提供重要参考。