慢性炎症性疾病间质单细胞图谱揭示共享的病理性成纤维细胞表型研究学术报告
本研究由一支国际研究团队合作完成，主要作者包括Ilya Korsunsky, Kevin Wei, Mathilde Pohin等，通讯作者为Fiona Powrie（牛津大学）、Christopher D. Buckley（牛津大学/伯明翰大学）、Michael B. Brenner（布莱根妇女医院/哈佛医学院）和Soumya Raychaudhuri（布莱根妇女医院/哈佛医学院/博德研究所）。该研究于2022年7月8日发表在Cell Press旗下的医学期刊《MED》（第3卷，第481-518页），论文题为“Cross-tissue, single-cell stromal atlas identifies shared pathological fibroblast phenotypes in four chronic inflammatory diseases”。
一、学术背景与研究目的
成纤维细胞（Fibroblasts）是存在于所有组织中的常驻细胞，在发育、伤口愈合、维持组织结构以及病理状态下的组织炎症、纤维化和癌症反应中扮演核心角色。近年来，单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术已被广泛应用于慢性炎症性疾病的研究，旨在识别与病理性炎症相关的、分子特征各异的成纤维细胞亚群。例如，在溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）中发现了表达Oncostatin-M受体（OSMR）和Podoplanin（PDPN）的基质细胞；在特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）中鉴定出COL3A1+ACTA2+肌成纤维细胞等。
然而，成纤维细胞表型的高度异质性，加之缺乏跨组织的统一分类标准，限制了我们理解哪些成纤维细胞激活通路在不同疾病中是共享的。一个关键的科学和临床问题是：炎症相关的成纤维细胞是组织特异性的，还是代表了跨不同疾病出现的共享激活状态？识别这种共享的病理性成纤维细胞程序具有重大临床意义，因为针对共享靶点的药物可能用于治疗多种炎症性疾病。本研究旨在通过构建跨组织、跨疾病的单细胞基质图谱，系统性探究并鉴定在多种慢性炎症性疾病中普遍存在的病理性成纤维细胞表型。
二、详细研究流程
本研究是一项综合性的计算与实验生物学研究，其工作流程复杂且环环相扣，主要可分为以下几个核心步骤：
1. 样本收集与单细胞转录组测序： 研究团队从患有四种慢性炎症性疾病的患者以及对照个体中，收集了目标组织的样本。具体包括：类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）和骨关节炎（osteoarthritis, OA）患者的关节滑膜；溃疡性结肠炎（UC）患者和对照组的结肠活检组织（包含部分患者的配对炎症与非炎症组织）；间质性肺病（interstitial lung disease, ILD）患者和对照组的肺活检或移植肺组织（包括早期ILD和终末期IPF/RA-ILD）；以及原发性干燥综合征（primary Sjögren‘s syndrome, pSS）患者和非干燥综合征对照的唇腺活检组织。总计分析了来自74个高质量样本的细胞。
为了富集基质细胞，在滑膜和肠道样本中，研究团队使用流式细胞术分选了活的CD45-Epcam-细胞（即去除免疫细胞和上皮细胞）。对于细胞数量较少的唇腺样本和细胞分选会降低成纤维细胞得率的肺样本，则未进行分选。所有样本均采用基于液滴的10x Genomics平台进行scRNA-seq。经过严格的质量控制，最终获得了221,296个高质量细胞的转录组数据。通过聚类分析，首先鉴定出7种主要细胞类型，包括成纤维细胞、内皮细胞、周血管壁细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、浆细胞和白细胞。
2. 组织内成纤维细胞异质性分析与跨组织整合聚类： 首先，研究者对四种组织内的成纤维细胞分别进行了细粒度聚类分析，在每个组织内部鉴定出已知的成纤维细胞亚群（共计17个），例如肠道中的WNT2B+FOSHI、RSPO3+亚群，肺中的PLIN2+、肌成纤维细胞亚群，滑膜中的PRG4+、THY1+、HLA-DRA+亚群，以及唇腺中的CD34+、CCL19+亚群。这验证了数据质量并重现了既往研究结果。
随后，研究的核心创新步骤是构建跨组织的成纤维细胞整合图谱。研究者汇集了来自滑膜、肠道、唇腺和肺的所有成纤维细胞（总计约79,000个）。为了解决不同组织细胞数量不平衡（例如滑膜细胞数远多于肺）以及供体、组织来源等因素对基因表达的复杂影响，他们开发了一套新颖的分析流程。该流程的关键点包括： * 加权主成分分析（Weighted PCA）：通过给细胞分配权重，使每个组织在分析中的总权重相等，从而减少细胞数量差异带来的偏差。 * 改进的Harmony算法整合：创新性地将供体和组织效应作为两个变量同时进行整合，有效对齐了来自不同供体和组织的细胞，生成了一个“和谐”的、供体与组织效应被移除后的共享特征空间。在整合后的空间中，细胞不再按组织聚集，而是按潜在的细胞状态聚集。 * 图聚类识别共享状态：在整合后的低维空间中进行图聚类，最终鉴定出14个跨组织存在的成纤维细胞整合簇（标记为C0-C13）。
3. 整合簇的基因表达分析与表型定义： 为了区分这些整合簇中哪些是跨组织共享的表型，哪些可能残留组织特异性，研究者采用了混合效应回归模型进行层次化差异表达分析。这种方法能够同时估计每个基因在特定簇中的平均表达变化（跨组织共享效应）以及在不同组织中的特异性表达变化。通过严格标准（在全部四种组织中均显著高表达），他们从14个整合簇中鉴定出5个具有强有力共享基因标记的簇。其中两个被特别关注：CXCL10+CCL19+ C11簇 和 SPARC+COL3A1+ C4簇。其余三个共享簇（FBln1+ C5， CD34+MFAP5+ C9， PTGS2+SEMA4A+ C8）和缺乏共享标记的簇则被归类为其他。
4. 炎症相关成纤维细胞表型的鉴定与验证： 为了确定哪些成纤维细胞表型在炎症组织中扩增，研究者定义了一个组织不可知的标准化炎症评分：基于每个样本中CD45+免疫细胞所占比例，并将其标准化到0-1的范围。使用此评分，通过混合效应逻辑回归模型，分别评估了每个组织中各成纤维细胞簇的丰度与炎症程度的关系，并进行荟萃分析（meta-analysis）。结果显示，CXCL10+CCL19+ C11簇和SPARC+COL3A1+ C4簇是唯一在全部四种疾病的炎症组织中均显著扩增的成纤维细胞表型。
为了理解这两种表型的功能，研究者进行了深入的生信分析： * 基因集富集分析（GSEA）：C11簇（免疫交互型）的标记基因富集于淋巴细胞趋化、抗原呈递、T细胞增殖正调控等通路，并对干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素-1（IL-1）等炎症细胞因子有强烈反应。C4簇（血管交互型）的标记基因则富集于细胞外基质（ECM）结合与重塑、以及多种发育通路（如TGF-β, Wnt, BMP, Notch信号通路）。 * 转录因子与配体-受体分析：预测的活跃转录因子与上述通路一致。配体-受体分析进一步揭示，C4簇的成纤维细胞与内皮细胞之间存在大量潜在的信号交互（如DLL4-NOTCH3, PDGFB-PDGFRB），提示其与血管微环境的密切互动。
5. 空间定位与体外功能验证： 为了在组织原位验证生信分析的预测，研究团队对RA滑膜、pSS唇腺和UC肠道样本进行了高维成像质谱（high-dimensional imaging）分析。通过细胞分割、标志物强度量化和空间聚类，他们定义了淋巴富集区、血管区和周血管区等解剖龛位。定量共定位分析证实，CCL19+成纤维细胞（C11表型）显著富集于T淋巴细胞富集的淋巴龛位，而SPARC+成纤维细胞（C4表型）则显著富集于富含周血管壁细胞（如α-SMA+细胞）的区域。
为了验证微环境信号是否足以诱导出这两种表型，研究者进行了体外实验。他们将RA滑膜和ILD肺来源的成纤维细胞与活化T细胞的上清共培养，或与内皮细胞共培养。scRNA-seq分析显示，T细胞信号诱导的基因表达谱在两种组织来源的成纤维细胞中高度相似，并且与C11簇的标记基因特征强烈相关。常规2D内皮共培养未能特异性诱导C4特征，但当使用能形成血管样结构的3D滑膜类器官模型时，成纤维细胞表现出明显的C4簇（SPARC+COL3A1+）基因特征。这表明C4表型的诱导需要更接近生理的血管结构微环境。
6. 在独立数据集和额外组织中的验证： 为了评估研究结果的普适性，研究者将他们的整合图谱应用于多个独立数据集： * 将来自特发性肺纤维化（IPF）研究的独立肺成纤维细胞scRNA-seq数据映射到本研究的图谱，发现C4（血管型）和C13（肌成纤维细胞）簇在IPF中扩增，而C11（免疫型）簇不显著，这与IPF以纤维化而非急性炎症为主的病理特征相符。 * 使用公开的健康成人肠道细胞图谱数据，验证了本研究鉴定的肠道成纤维细胞亚型与已知健康亚型的一致性。 * 作为概念验证，研究团队还分析了特应性皮炎（atopic dermatitis, AD） 皮肤组织的scRNA-seq数据。将皮肤成纤维细胞映射到本研究的跨组织图谱后，发现AD皮损区域的成纤维细胞同样显著富集了CXCL10+CCL19+ C11簇和SPARC+COL3A1+ C4簇。空间分析进一步确认了CCL19+成纤维细胞与T细胞、SPARC+成纤维细胞与血管/周血管区域的共定位。这有力地证明了这两种病理性成纤维细胞表型超出了最初研究的四种疾病范围，可能是在慢性炎症中普遍存在的共享激活状态。
三、主要研究结果
四、研究结论与意义
本研究得出结论：尽管慢性炎症性疾病影响不同的器官，但它们共享两种保守的病理性成纤维细胞激活状态——免疫交互型成纤维细胞和血管交互型成纤维细胞。这些状态并非固定的细胞谱系，而是由特定组织微环境（T细胞或血管）信号诱导的可逆激活表型。
这项工作的科学价值在于：它超越了单一疾病或组织的视角，首次在系统水平上揭示了慢性炎症中基质细胞的共同病理机制，为理解复杂疾病的共性提供了新的框架。其应用价值尤为显著：鉴定出的这两种共享成纤维细胞表型及其驱动信号通路（如C11的IFN响应、C4的Notch信号），为开发广谱性、针对“疾病共性”而非“器官特异性”的新型治疗策略提供了极具潜力的靶点。例如，一种针对这两种活化成纤维细胞共有弱点的药物，可能对多种慢性炎症性疾病有效。
五、研究亮点