关于稳定型冠状动脉疾病患者血小板功能增强及循环中单核细胞-血小板聚集体增加的研究报告

主要作者及发表信息

本研究的通讯作者为Mark I. Furman博士，其研究单位隶属于马萨诸塞大学医学中心（University of Massachusetts Medical Center）心血管血栓形成研究中心下的血小板功能研究中心。该研究于1998年2月发表在《美国心脏病学会杂志》（Journal of the American College of Cardiology, JACC）第31卷第2期，页码为352至358页。

研究背景与目的

本研究的基础科学领域是心血管病理生理学，聚焦于动脉粥样硬化（atherosclerosis）中血栓形成与炎症的交互作用。在学术背景方面，动脉粥样硬化的病理生理过程涉及血栓形成和炎症两大核心事件，而细胞活化在其中扮演着主导角色。此前，对这两个过程的研究多独立进行，但由P-选择素（P-selectin，亦称CD62P）介导的血小板与白细胞的异型性相互作用已开始成为学界关注的焦点。

在急性冠状动脉综合征（acute coronary artery syndromes）中，血小板活化的血清学标志物升高已被充分证实。然而，关于稳定型冠状动脉疾病（stable coronary artery disease, CAD）患者体内是否存在高反应性或“预激活”（primed）血小板，一直缺乏直接证据。同时，越来越多的证据表明白细胞和体液炎症介质在冠状动脉粥样硬化的发病机制中扮演重要角色。

基于此，本研究的目的在于，利用全血流式细胞术（whole blood flow cytometry）这一能在最小人工活化干扰下直接分析单个细胞的技术，来探讨两个核心问题：第一，稳定型CAD患者是否具有增强的血小板反应性（platelet reactivity）；第二，这些患者是否具有更强的形成单核细胞-血小板聚集体（monocyte-platelet aggregates）的倾向。

研究工作流程与实验方法

本研究严格按照对比研究设计展开，共纳入19名稳定型心绞痛（stable angina）患者作为研究组，以及19名健康不吸烟的成年志愿者作为正常对照组。所有患者均在接受门诊心导管检查前采血，并且近3个月内无静息性心绞痛或心肌梗死（myocardial infarction, MI）发作。对照组在采血前至少10天内未服用任何抗血小板药物。

实验流程的核心是全血流式细胞术分析，主要分为以下三个相互关联的检测程序：

程序一：血小板活化状态的检测。 从患者和对照组的外周静脉抽取枸橼酸钠抗凝的血液，在15分钟内进行1:4稀释处理。为模拟体内不同程度的刺激，稀释后的血液样本分别被置于六种不同条件下孵育10分钟：无激动剂（用以测定循环中已活化的血小板）；不同浓度组合的激动剂，包括低浓度（1 μmol/liter）和高浓度（10 μmol/liter）的腺苷二磷酸（adenosine diphosphate, ADP）；ADP与肾上腺素（epinephrine）的联合应用；低浓度（5 μmol/liter）和高浓度（30 μmol/liter）的凝血酶受体激动肽（thrombin receptor agonist peptide, TRAP）；以及纯化人α-凝血酶（2 U/ml）。 孵育后，所有样本经1%甲醛固定，随后与荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的、针对血小板糖蛋白IIIa（GPIIIa）的抗体Y2/51及生物素化的P-选择素特异性抗体S12共同孵育。该研究中，采用Y2/51抗体和特征性光散射（light scatter）设门来准确识别血小板，再通过藻红蛋白（phycoerythrin）结合链霉亲和素（streptavidin）的信号来分析S12的结合情况。通过在流式细胞仪上分析5000个血小板的荧光强度，定义了P-选择素阳性血小板的百分比。此项分析均在固定后4小时内完成，以确保抗原决定簇的稳定性。

程序二：单核细胞-血小板与中性粒细胞-血小板聚集体的检测。 稀释后的血液样本与FITC标记的、针对GPIIb-IIIa复合物的单克隆抗体7E3共孵育，并接受与程序一相同的六种激动剂条件处理。经过固定和溶血处理后，利用流式细胞仪，通过特征性光散射识别出单核细胞和中性粒细胞群，再通过检测7E3的荧光信号来标记粘附了血小板的细胞。最终，通过分析1000个单核细胞和5000个中性粒细胞，计算出血小板阳性细胞所占比率。为验证这些聚集体的形成机制，研究团队在实验体系中加入P-选择素特异性阻断抗体G1，结果完全阻断了聚集体的形成，证实了这一过程是P-选择素依赖性的。

程序三：单核细胞活化状态的检测。 为评估单核细胞在无刺激条件下的基础活化水平，研究团队将稀释后的血液样本直接与FITC标记的、针对活化依赖性抗原CD11b（又称Mac-1）的单克隆抗体Bear1共孵育，随后固定并上机检测。通过设定背景对照（FITC标记的非特异性鼠IgG），得到净荧光强度，用以量化单核细胞表面CD11b的表达。

数据统计分析采用配对t检验（paired t test）比较两组间的差异。

主要研究结果

研究结果清晰地揭示了稳定型CAD患者中存在的血小板和白细胞功能异常。

在循环活化血小板方面，与正常对照组（p < 0.01）相比，稳定型CAD患者外周血中未受激动剂刺激即存在的表面P-选择素阳性血小板百分比显著升高（平均值 ± 标准误：2.1 ± 0.2% vs. 1.5 ± 0.2%）。这表明患者体内存在持续的血小板脱颗粒过程。

在血小板反应性方面，当用低浓度激动剂刺激时，患者的血小板表现出显著增高的反应性。响应1 μmol/liter ADP刺激时，患者与对照组的P-选择素阳性血小板比例分别为28.7 ± 3.9%与16.1 ± 2.2%（p < 0.01）；响应1 μmol/liter ADP/肾上腺素时为51.4 ± 4.6%与37.5 ± 3.8%（p < 0.05）；而在响应5 μmol/liter TRAP时差异最为显著，分别为65.7 ± 6.8%与20.2 ± 5.1%（p < 0.01）。这一组对比揭示了患者血小板处于“预激活”状态的直接证据。尤为关键的是，当使用高浓度激动剂进行最大强度刺激时，两组间血小板P-选择素表达量并无显著差异。这一结果排除了患者血小板因含有更多可供释放的P-选择素而导致高反应的可能，而是说明其细胞内信号通路发生了改变，使得它们对激动剂更敏感。

在循环单核细胞-血小板聚集体方面，稳定型CAD患者显著高于对照组（15.3 ± 3.0% vs. 6.3 ± 0.9%, p < 0.01）。与此形成对比的是，循环中的中性粒细胞-血小板聚集体（6.8 ± 1.2% vs. 5.6 ± 1.0%, p = 0.10）在两组间无统计学差异。

在形成聚集体的倾向性方面，患者组在低浓度激动剂刺激下展现出更强的形成单核细胞-血小板聚集体的能力。对1 μmol/liter ADP的反应对比为50.4 ± 4.5% vs. 28.1 ± 5.3%（p < 0.01）；对1 μmol/liter ADP/肾上腺素的反应为60.7 ± 4.3% vs. 48.0 ± 4.8%（p < 0.05）；对5 μmol/liter TRAP的反应为67.6 ± 5.7% vs. 34.3 ± 7.0%（p < 0.01）。与血小板反应性结果一致，当激动剂浓度达到最大时，两组差异消失。中性粒细胞-血小板聚集体的形成倾向在所有测试条件下均未见组间差异。

在单核细胞活化方面，通过测定表面CD11b的表达，未发现稳定型CAD患者亚组之间存在统计学差异。

研究结论与价值

本研究得出明确结论：稳定型冠状动脉疾病患者体内存在循环脱颗粒血小板、循环单核细胞-血小板聚集体、增强的血小板反应性以及增强的形成单核细胞-血小板聚集体的倾向性。

这项研究的科学价值在于，它首次利用全血流式细胞术这一灵敏且人工干扰极小的方法，为稳定型CAD患者存在血小板“预激活”状态以及选择性增强的单核细胞-血小板相互作用提供了直接证据，将传统上独立研究的血栓与炎症过程在细胞水平上紧密联系起来。研究揭示了即使在没有急性缺血事件发生时，动脉粥样硬化也是一种持续性的细胞活化过程。其潜在的临床价值在于，这些循环中的细胞活化标志物可能成为更具指示意义的风险分层指标。论文结尾提到，一个大规模前瞻性研究正在进行，旨在回答血小板反应性和单核细胞-血小板聚集的增强程度是否与特定的临床事件相关，这为未来的应用转化指出了方向。

研究亮点

本研究的方法学亮点在于全血流式细胞术的应用，其最核心的优势是避免了离心、搅拌等体外操作造成的人为血小板活化，能够在接近生理状态的全血环境中直接分析单个细胞的活化状态及其相互作用，这是对当时广泛使用的、易产生人工伪象的血小板分泌产物测定法的重要改进。研究中最具洞察力的发现是高浓度激动剂能使患者与正常人的血小板脱颗粒达到同等水平，这一设计巧妙地证明了患者血小板的异常不在于P-选择素总量增加，而在于反应阈值降低，即在“预激活”状态下。此外，研究还发现血小板倾向于选择性地与单核细胞形成循环聚集体，而非中性粒细胞，这一细胞特异性的发现，结合血小板能通过P-选择素诱导单核细胞表达组织因子等后续研究，共同指向了血小板-单核细胞的聚集可能不仅仅是活化的标志，更是推动炎症和血栓形成的新靶点。