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研究作者与发表信息 该研究由Amelia Acha-Sagredo、Pietro Andrei、Kalum Clayton等人共同完成，其中Amelia Acha-Sagredo、Pietro Andrei和Kalum Clayton为共同第一作者，Elisa Fontana、Manuel Rodriguez-Justo与Francesca D. Ciccarelli为共同资深作者。研究团队的通讯作者是来自伦敦玛丽女王大学巴茨癌症研究所和弗朗西斯·克里克研究所的Francesca D. Ciccarelli教授。这项研究成果于2025年2月10日发表在期刊《Cancer Cell》上。

研究背景与目的 基于免疫检查点抑制的癌症疗法革新了转移性错配修复缺陷或微卫星高度不稳定结直肠癌的治疗格局，但临床上仍然只有不到50%的晚期或转移性错配修复缺陷结直肠癌患者对此疗法产生应答。而占结直肠癌约90%的错配修复功能正常患者，目前普遍不适合接受免疫检查点抑制治疗。因此，临床上迫切需要能够超越肿瘤突变负荷预测、并适用于两种结直肠癌亚型的免疫治疗应答预测标志物。本研究旨在深入理解错配修复缺陷和错配修复功能正常结直肠癌的肿瘤微环境调控机制，寻找能够预测免疫治疗临床获益的通用标志物，从而扩大免疫治疗的受益人群。

研究设计与流程 研究团队首先收集了来自28例错配修复缺陷和30例错配修复功能正常结直肠癌患者的59个肿瘤组织蜡块进行多区域转录组学分析。通过激光捕获显微切割技术，研究人员从肿瘤核心和侵袭边缘区域分别分离出肿瘤上皮、肿瘤相关基质以及邻近正常上皮组织，实现了对肿瘤内在特性与外在免疫微环境特性的独立比较。利用优化的低起始量RNA测序方案，每个样本可检测约11500个基因的表达。随后，研究人员使用29个手动筛选的基因特征集进行单样本基因集富集分析，其中14个特征集用于捕获结直肠癌内在分子程序，15个特征集用于量化免疫细胞浸润及其功能。通过无监督层次聚类分析，研究团队将全部样本划分为四个具有不同免疫特性的亚群，进一步归类为干扰素高免疫表型和干扰素低免疫表型两大类。

为深入解析局部肿瘤-免疫细胞互作关系，团队对两例免疫治疗应答的错配修复缺陷和两例干扰素高免疫表型的错配修复功能正常结直肠癌样本，应用CosMx单细胞空间转录组学技术进行了分析。通过免疫荧光染色标记上皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞和淋巴细胞，并结合单细胞结直肠癌数据进行监督式细胞注释，研究者精确比较了T细胞邻近与非邻近区域的肿瘤相关巨噬细胞、上皮细胞和T细胞的基因表达差异。同时，研究团队设计了体外共培养实验，将人类原代活化CD8+ T细胞分别与错配修复缺陷的HCT116和错配修复功能正常的Caco2结直肠癌细胞系共培养，并使用干扰素-γ中和抗体处理，以验证空间转录组学的发现。

在标志物验证阶段，研究团队对22例接受抗PD-1免疫治疗的错配修复缺陷结直肠癌患者的肿瘤组织切片进行CD74免疫组化染色，参考PD-L1评分体系建立了四种定量评分方法：联合阳性评分、基质比例评分、肿瘤比例评分和基质细胞比例评分。随后在来自另一独立中心的43例验证队列中对结果进行了确认。为验证CD74在错配修复功能正常结直肠癌中的预测价值，团队分析了来自Camilla和AtezoTribe临床试验的样本，分别利用GeoMx空间转录组学数据和免疫组化染色进行CD74定量。此外，研究者还建立了同基因小鼠模型，将错配修复功能正常CT26和错配修复缺陷MC38细胞系植入免疫功能正常的小鼠体内，给予抗PD-1或IgG对照抗体治疗，比较肿瘤生长抑制率与CD74表达水平的关系。

主要研究结果 通过多区域转录组学分析，研究发现肿瘤上皮与基质之间的转录组差异超过了两类结直肠癌亚型之间的差异，而肿瘤核心与侵袭边缘之间的转录组异质性相对较低。错配修复缺陷结直肠癌整体表现出更高的转录组多样性和免疫浸润水平。在肿瘤内在特性方面，错配修复缺陷肿瘤的干扰素应答和STING通路激活水平均显著高于错配修复功能正常肿瘤。免疫浸润分析进一步揭示了肿瘤微环境的关键特征：错配修复缺陷结直肠癌内自然杀伤细胞、细胞毒性淋巴细胞和CXCL10阳性肿瘤相关巨噬细胞这三种免疫群体的浸润不仅在基质中显著富集，在上皮内浸润水平也明显更高，且两者呈正相关，提示这些免疫细胞源自基质而非组织驻留。免疫组化染色证实了相关免疫细胞标记物的表达与基因特征富集分数之间的正相关性。

层次聚类分析将全部结直肠癌分为四个聚类，其中聚类A以错配修复缺陷肿瘤为主，表现出最高的免疫浸润和肿瘤干扰素应答水平；聚类B以混合亚型为特征，具有较高的基质免疫浸润和略低的上皮内浸润；聚类C和D则总体免疫水平较低。据此，研究者将前两类定义为干扰素高免疫表型，后两类为干扰素低免疫表型。干扰素高免疫表型肿瘤的IFNG基因表达显著更高，且几乎所有其他免疫群体的浸润均更为丰富。值得注意的是，肿瘤突变负荷在两种免疫表型之间并无显著差异，表明免疫浸润水平并非由肿瘤免疫原性的量决定。干扰素高免疫表型显著富集于对抗PD-1免疫治疗应答的错配修复缺陷患者中，并显著排斥肝转移患者，这与肝转移作为免疫治疗耐药标志的临床观察一致。

单细胞空间转录组学分析进一步揭示了关键的空间调控机制。与T细胞邻近的肿瘤相关巨噬细胞中，参与抗原加工与呈递以及干扰素应答的基因显著上调。类似地，邻近T细胞的肿瘤上皮细胞同样表现出抗原加工呈递和干扰素应答通路的整体激活。在上皮内T细胞中，与细胞毒性和耗竭相关的基因表达增加。在T细胞邻近的巨噬细胞和肿瘤细胞共同过表达的7个基因中，CD74、CXCL9、CCL5和CXCL10同时在干扰素高免疫表型结直肠癌的基质和上皮中一致高表达。其中，MHC-II类分子恒定链CD74因其既在肿瘤相关巨噬细胞高表达又在肿瘤上皮中受诱导表达的特性脱颖而出。体外共培养实验证实，活化CD8+ T细胞能够直接诱导HCT116和Caco2细胞中CD74的表达上调，而这种效应在HCT116中完全依赖于干扰素-γ信号，Caco2细胞中则存在干扰素-γ非依赖的调控机制。

在临床验证方面，CD74基质细胞比例评分在四种评分体系中能够最佳地区分错配修复缺陷免疫治疗应答者和非应答者。以18%为阈值，诊断灵敏度和特异度均达到理想水平。不仅抗PD-1单药治疗患者，接受抗PD-1联合抗CTLA-4联合治疗的患者在该阈值下同样得到显著区分。在错配修复功能正常结直肠癌的验证中，所有被归类为干扰素高免疫表型的患者其CD74基质比例评分均超过18%。来自Camilla试验的预处理转移性活检数据显示，免疫治疗应答者肿瘤区和基质区的CD74表达水平均显著高于非应答者。AtezoTribe试验进一步表明，在接受手术切除原发灶的转移性错配修复功能正常结直肠癌患者中，高CD74基质比例评分在阿替利珠单抗实验组显示出改善无进展生存期的预测价值。

小鼠模型的实验结果进一步佐证了CD74的预测价值。MC38和CT26具有相似的肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性评分，但MC38对抗PD-1治疗表现出显著应答而CT26表现出耐药。对接受IgG对照抗体处理的小鼠肿瘤分析发现，MC38肿瘤的CD74基因和蛋白表达均显著高于CT26，表明CD74高表达能够预先指示对抗PD-1免疫治疗的敏感性，与其他免疫治疗反应预测因素无关。

研究结论与价值 本研究证实肿瘤免疫微环境的组成是决定结直肠癌免疫治疗应答的核心标志。错配修复缺陷和错配修复功能正常结直肠癌之间存在显著且重叠的免疫微环境异质性，一个由细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞以及CXCL10阳性肿瘤相关巨噬细胞局部富集所定义的干扰素高免疫表型，是免疫治疗应答的必要条件。研究揭示了CD8+ T细胞通过干扰素-γ诱导邻近巨噬细胞和肿瘤细胞上调包括CD74在内的抗原呈递机制的分子空间机制。最为关键的是，CD74作为一种单一的免疫组化标志物，其表达丰度能够独立于肿瘤突变负荷和错配修复状态，识别出能够从免疫检查点抑制治疗中获得临床获益的结直肠癌患者，包括约20%的错配修复功能正常结直肠癌患者。这一发现有望标准化为临床检测，显著扩大结直肠癌免疫治疗的受益人群。

研究亮点与创新性 本研究的创新性体现在多个层面。在实验设计上，采用激光捕获显微切割分离肿瘤上皮和基质进行独立转录组分析，使得研究者能够区分肿瘤内在特性与微环境外在特性对免疫表型的贡献。在技术应用上，整合了单细胞空间转录组学、体外T细胞-肿瘤细胞共培养体系和同基因小鼠模型，形成了从组织观察到机制验证再到临床转化的完整证据链。在标志物开发策略上，突破了肿瘤突变负荷的局限，开发出基于单一蛋白标志物CD74的标准化免疫组化评分体系，具备直接的临床普适性和可操作性。在临床价值上，同时涵盖了错配修复缺陷和错配修复功能正常两大类患者群体，且对单药和联合免疫治疗方案均显示出预测效力，为结直肠癌的精准免疫治疗提供了亚型无关的生物标志物新策略。