本文介绍了一项由魏继华、邱志立、于德红、尹一鸣、汤千里、廖先就*、张关群、刘钊*、高风雷**等研究人员共同完成的原创性研究。该研究发表于《Sensors and Actuators: B. Chemical》期刊第384卷（2023年），文章在线发表日期为2023年3月13日。

一、 研究背景与目的

本研究属于生物传感与分析化学交叉领域，具体聚焦于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）生物标志物的高灵敏度检测。阿尔茨海默病是一种以认知和行为障碍为特征的神经退行性疾病，其病理特征包括神经元内神经原纤维缠结和细胞外老年斑的形成。Tau蛋白是构成神经原纤维缠结的主要成分，其异常磷酸化和聚集与AD的发病机制密切相关。研究表明，脑脊液和血液中Tau蛋白的水平是反映AD病理变化和神经元损伤程度的重要分子生物标志物。因此，开发高灵敏度、高特异性、可靠的Tau蛋白检测技术对于AD的早期诊断、病情监测和治疗评估具有至关重要的意义。

目前，Tau蛋白的检测主要依赖于酶联免疫吸附测定（ELISA）等免疫分析方法，但这些方法通常步骤繁琐、耗时较长，且灵敏度有时难以满足早期诊断中对极低浓度生物标志物的检测需求。近年来，基于适配体（Aptamer）的传感技术因其高亲和力、高特异性和易于修饰等优点而受到广泛关注。然而，简单的适配体结合检测技术，若无信号放大策略，难以实现低丰度Tau蛋白的超灵敏检测。因此，开发集成高效信号放大机制的生物传感器成为当前研究的热点。

在众多信号放大策略中，DNA步行机（DNA walker）作为一种自主运动的分子机器，因其能够通过级联反应产生显著的信号放大效应而备受青睐。传统的单腿DNA步行机存在行走速度慢、行走范围有限等缺点。为了提高反应动力学和过程性，多足DNA步行机（如三足DNA步行机）被设计出来，其通过增加“腿”的数量，显著提升了行走效率和信号生成速度。

基于此，本研究旨在构建一种新型的、无标记的电化学适配体传感器，用于超灵敏检测Tau蛋白。该传感器巧妙地将Mg²⁺依赖的DNA酶（Mg²⁺-DNAzyme，文中简写为MNazyme）驱动的三足DNA步行机（Tripedal DNA Walker）与杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction, HCR）相结合，实现三重信号放大，以期达到极高的检测灵敏度，并验证其在复杂生物样品（如人血清）中的应用潜力。

二、 研究详细工作流程

本研究的工作流程是一个精心设计的、多步骤的级联生物化学放大过程，主要包含以下几个核心步骤：

1. 三足DNA步行机的靶标触发自组装：该过程在溶液中进行。首先，将目标物Tau蛋白与其特异性适配体（文中称为MB0，一种发夹结构DNA）混合。Tau蛋白与MB0结合后，导致MB0的发夹结构打开，暴露出其最初被封闭的“立足点”（toehold）区域。随后，这个暴露的立足点与第一个预设计的发夹探针MB1的立足点互补结合，引发链置换反应，使MB1的结构发生变化并暴露出新的立足点。此新立足点进而与第二个发夹探针MB2结合并引发类似的链置换，暴露出MB2上的立足点。该立足点再与第三个发夹探针MB3结合。最终，MB1、MB2和MB3通过连续的链置换反应自组装成一个Y形DNA结构。关键的是，在此循环中，Tau蛋白-MB0复合物会被释放出来，继续参与下一轮反应，从而实现目标物的循环利用和Y形结构的持续生成。这个Y形结构具有三条单链DNA“腿”，因此被称为“三足DNA步行机”。此步骤通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和荧光实验验证了步行机的成功形成。

2. 电极表面DNA轨道的制备：在另一条实验线上，对金电极（AuE）进行修饰。首先，将硫醇化修饰的分子信标MB4通过Au-S键自组装固定在金电极表面。MB4同样是一个发夹结构DNA，其环状部分包含一段能被特定DNA酶切割的底物序列。随后，用6-巯基-1-己醇（MCH）封闭电极表面剩余的空位，以减少非特异性吸附。

3. DNA酶驱动的三足DNA步行机行走与切割：将步骤1中生成的含有三足DNA步行机的混合溶液滴加到修饰有MB4的电极上。三足DNA步行机的任意一条“腿”都可以与电极表面的MB4通过碱基互补配对杂交。当溶液中存在Mg²⁺时，步行机“腿”上携带的DNA酶序列与MB4上的底物序列共同形成一个有催化活性的Mg²⁺-DNA酶结构。该DNA酶将MB4的底物序列在特定位置切割，产生两个DNA片段。切割后，步行机从被切割的MB4上解离，成为自由的末端，随即在电极表面寻找并杂交到下一个完整的MB4分子上，重复切割过程。这样，一个三足DNA步行机就可以在电极表面“行走”，并持续切割大量的MB4分子，释放出许多短的DNA片段（即被切割的MB4的一部分）。这一过程通过电化学阻抗谱（EIS）监测电极界面电荷转移电阻（Rct）的变化得以验证：步行机杂交后Rct增大，加入Mg²+切割后Rct减小。

4. 杂交链式反应（HCR）的引发与长链DNA生成：步骤3中释放的DNA片段中，有一个片段（作为引物）可以与溶液中游离的两种发夹DNA探针H1和H2相互作用。该引物打开H1的发夹结构，暴露出新的序列，进而与H2结合并打开H2的发夹，此过程又暴露出能与H1结合的序列，从而引发H1和H2交替杂交的链式反应。最终，在电极表面原位生成长达数微米的、包含大量重复腺嘌呤（A）碱基的双链DNA聚合物（HCR产物）。这一过程通过PAGE和扫描电子显微镜（SEM）观察到了高分子量的条带和长链DNA结构，证实了HCR的成功进行。

5. 银纳米颗粒（AgNPs）吸附与电化学信号读出：生成的HCR长链产物富含多聚腺嘌呤（poly A）序列。利用poly A与银纳米颗粒（AgNPs）之间强烈的相互作用（如Ag⁺与腺嘌呤的N原子配位），大量的AgNPs被吸附到电极表面的长链DNA上。随后，使用线性扫描溶出伏安法（LSV）进行检测。在特定电位下，吸附的AgNPs被氧化溶出为Ag⁺，产生明显的氧化电流峰。电流峰的大小与电极表面吸附的AgNPs数量成正比，而AgNPs的数量又取决于生成的HCR产物的量，最终与初始Tau蛋白的浓度相关，从而实现对Tau蛋白的定量检测。通过原子力显微镜（AFM）和SEM可以观察到AgNPs成功吸附在DNA长链上。

整个工作流程中，Tau蛋白触发了三足DNA步行机的组装，步行机的行走和切割实现了第一级放大（每个Tau蛋白可产生多个切割片段）；每个切割片段引发HCR，实现第二级指数放大（产生超长DNA链）；长链DNA吸附大量AgNPs，实现第三级放大（每个长链结合多个信号分子）。这种三重放大策略是本研究方法高灵敏度的核心。

三、 主要研究结果

1. 传感器构建与可行性验证：

   • 电化学表征：通过EIS对电极修饰的每一步进行了监测。裸金电极的Rct很小；固定MB4后，由于带负电的DNA骨架阻碍了电化学探针[Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻的电子传递，Rct显著增加；封闭剂MCH的加入进一步增大了Rct；加入三足DNA步行机杂交后，Rct继续增大；加入Mg²⁺进行切割后，部分DNA被切断并从电极表面脱离，导致Rct下降；进行HCR后，电极表面负载大量长链DNA，Rct急剧增大；最后吸附AgNPs后，由于AgNPs的良好导电性，Rct又有所下降。这一系列规律性的Rct变化证实了传感器按预期步骤成功构建。
   • 凝胶电泳与显微成像验证：PAGE实验清晰地显示了从发夹探针（MB1, MB2, MB3）到Y形三足DNA步行机（高分子量条带）的自组装过程，以及加入Mg²⁺后MB4被切割（条带消失）、加入H1/H2后形成更高分子量的HCR产物（条带滞留在加样孔附近）的过程。SEM图像直接观察到了长度超过2微米的HCR产物长链，以及AgNPs吸附在DNA长链上的形貌。AFM结果与SEM一致。这些结果从分子水平和微观形貌上证明了整个信号放大流程的可行性。
   • 电化学信号可行性：LSV控制实验表明，只有在包含所有必要组件（Tau蛋白、MB0、MB1、MB2、MB3、Mg²⁺、H1/H2、AgNPs）的完整体系下，才能观察到强烈的Ag溶出电流峰。缺少Tau蛋白、MB0、MB2或MB3时，电流信号显著降低甚至消失。特别地，缺少MB2（相当于单腿步行机）或MB3（相当于双腿步行机）时，信号强度低于完整的三足步行机体系，证明三足设计具有更快的行走动力学和更高的信号放大效率。动力学实验显示，三足步行机在100分钟内达到信号平台期，快于双腿（140分钟）和单腿步行机。

2. 实验条件优化：为了获得最佳检测性能，对关键实验参数进行了系统优化。结果表明：三足DNA步行机的最佳组装时间为50分钟；Mg²⁺-DNA酶切割MB4的最佳反应时间为100分钟；最佳AgNPs用量为14微升；最佳AgNPs孵育时间为60分钟；最佳Mg²⁺浓度为2.5 mM；最佳反应pH值为7.4。这些优化条件为后续灵敏度测试奠定了基础。

3. 分析性能评估：

   • 灵敏度与线性范围：在最优条件下，传感器对不同浓度的Tau蛋白（1 fM 至 0.1 nM）进行检测。LSV峰值电流随着Tau蛋白浓度的增加而增强。在1 fM 至 0.1 nM的浓度范围内，峰值电流与Tau蛋白浓度的对数（log C）呈现良好的线性关系，线性方程为 I = 22.25 + 1.45 log C (R² = 0.9891)。根据信噪比3σ计算得出的检测限（LOD）低至0.43 fM。与文献中报道的其他检测Tau蛋白的电化学、表面等离子体共振、光电化学和荧光方法相比（如表1所示），本研究提出的传感器在检测限和线性范围方面表现出显著优势，这得益于其三重信号放大策略。
   • 选择性与抗干扰性：为了评估传感器在复杂环境中的实用性，测试了其对可能共存于生物样品中的干扰物质的响应。实验选择了与AD相关的其他蛋白（如β-淀粉样蛋白单体Aβm、纤维Aβf、寡聚体Aβo）以及人血清中常见的蛋白（如免疫球蛋白G IgG、人血清白蛋白HSA）和分子（如L-半胱氨酸）。结果表明，即使在10 pM的高浓度下，这些干扰物质产生的电流信号也微乎其微，而1 pM的Tau蛋白则产生强烈的信号，证明了传感器基于适配体的高特异性。此外，在人血清基质常见成分（如K⁺, Cl⁻, 葡萄糖, 尿酸, 多巴胺, Zn²⁺, Cu²⁺）存在下，检测1 pM Tau蛋白的回收率良好，信号未受显著影响，表明传感器具有良好的抗干扰能力。
   • 重现性与稳定性：通过批内和批间实验评估了传感器的重现性。使用三个独立制备的传感器在相同条件下检测同一浓度Tau蛋白，得到的相对标准偏差（RSD）为3.4%，表明批间重现性良好。使用同一传感器对同一样品进行三次重复检测，RSD为3.6%，表明批内重现性良好。将制备好的传感器在4°C的HEPES缓冲液中储存14天，并定期测试其性能，发现电流响应保持在初始值的97%以上，RSD为2.8%，证明了传感器优异的稳定性。

4. 实际样品分析：为了验证传感器的实际应用潜力，将其用于检测人血清样品中的Tau蛋白。将从医院获取的三份人血清样品，用本研究构建的传感器和临床常用的电化学发光法（参考方法）进行平行检测。结果显示（如表2所示），两种方法测得的结果具有良好的一致性，相对标准偏差也相近（本方法RSD在3.61%-4.32%之间，电化学发光法在3.43%-4.31%之间）。这表明该传感器在实际复杂生物样品基质中具有可靠的检测能力，与标准方法结果吻合。

四、 研究结论与价值

本研究成功设计并构建了一种基于MNazyme驱动三足DNA步行机触发HCR的无标记电化学适配体传感器，用于阿尔茨海默病生物标志物Tau蛋白的超高灵敏度检测。

其科学价值和应用价值体现在： 1. 超高灵敏度：通过巧妙整合三足DNA步行机、DNA酶切割和HCR三重级联放大策略，将微弱的生物分子结合事件转化为强大的电化学信号，实现了0.43 fM的极低检测限和跨越5个数量级（1 fM – 0.1 nM）的宽线性范围，为痕量生物标志物的检测提供了强有力的工具。 2. 高特异性与可靠性：得益于Tau蛋白适配体的高亲和力与特异性，以及严谨的实验设计，传感器能够有效区分Tau蛋白与其他结构类似的干扰物，并在含有复杂成分的人血清样品中表现出良好的抗干扰能力和准确度，结果与临床标准方法具有可比性。 3. 无标记与操作简便性：整个检测过程无需对DNA进行复杂的化学标记（如荧光基团、电化学活性分子），仅利用DNA自身的碱基序列特性（如poly A与AgNPs的吸附）产生信号，降低了成本，简化了操作步骤。 4. 策略的普适性与扩展性：该传感平台的核心机制（靶标触发多足步行机组装、DNA酶驱动行走、HCR放大）具有模块化特点。通过更换与不同靶标（如其他蛋白质、小分子、核酸）特异性结合的适配体或识别元件，该策略可以很容易地扩展到其他生物标志物的检测中，显示出广阔的应用前景。

五、 研究亮点

1. 创新的三重信号放大设计：首次将Mg²⁺-DNA酶驱动的三足DNA步行机与HCR相结合用于电化学检测。三足设计相比传统的单腿或双腿步行机，显著提高了行走速度和过程性；DNA酶切割实现酶促放大；HCR实现指数放大。三者协同，产生了卓越的灵敏度提升。
2. 高效的三足DNA步行机：通过巧妙的发夹探针设计，实现了由靶标Tau蛋白触发的、自动循环的三足DNA步行机自组装。该步行机无需预先固定在纳米颗粒上，是“自由运行”的，简化了制备过程，并提高了反应效率。
3. 灵敏且简便的信号读出方式：利用HCR产物中富含的poly A序列大量吸附银纳米颗粒，再通过电化学溶出分析进行检测。该方法信号强、背景低，且避免了复杂的DNA标记过程。
4. 成功的实际应用验证：不仅进行了系统的性能表征和优化，还成功地将传感器应用于真实人血清样品中Tau蛋白的检测，并与临床方法进行了对比，证明了其在实际诊断应用中的可行性和可靠性，为阿尔茨海默病的早期无创或微创血液检测提供了有潜力的新方法。