研究论文报告
一、研究基本信息
本研究由冯麒麟、王晨、石思、范俊宇、陈玉蓉、张团杰、阮志军、马永政、李子福、刘杰及陈柏竹等人完成，主要通讯作者为陈柏竹，单位包括中山大学深圳校区生物医学工程学院、广东省传感技术与生物医学仪器重点实验室、深圳湾实验室坪山转化医学中心、天津大学海洋科学与技术学院以及华中科技大学生命科学与技术学院。该研究发表于 *Advanced Healthcare Materials*，在线发表日期为2026年，DOI编号为10.1002/adhm.202503275。
二、研究背景与目的
肿瘤细胞通过代谢重编程（metabolic reprogramming）改变能量代谢途径并重塑肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），以维持其快速增殖与转移，同时导致免疫抑制。葡萄糖和乳酸（lactate）是肿瘤细胞能量代谢中两个关键代谢物：葡萄糖通过有氧糖酵解（Warburg效应）为肿瘤提供快速能量，而乳酸则进一步促进免疫抑制微环境的形成。传统肿瘤治疗手段对代谢调控和免疫激活的联合作用有限。
受工程化活性材料（engineered living materials, ELMs）设计理念启发，研究者提出利用工程化细菌作为“生物工厂”，在肿瘤部位按需表达代谢酶，从而实现对肿瘤能量代谢的调控并增强免疫治疗。本研究旨在构建一种光触发、基于AND门逻辑的活性水凝胶系统，通过共表达乳酸氧化酶（lactate oxidase, LOX）和葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GOX）两种代谢酶，实现对肿瘤糖酵解的抑制和线粒体呼吸的正常化，最终增强抗肿瘤免疫应答。
三、研究流程与实验方法
本研究主要分为体外制备与表征、体外抗肿瘤与代谢调控实验以及体内抗肿瘤与免疫评价三个层次。
（一）工程化活性水凝胶（EBPH）的制备与表征
研究者选择大肠杆菌BL21(DE3)作为底盘细胞，构建了含有热敏启动子（thermosensitive promoter）控制的LOX和GOX表达载体。在45°C诱导条件下，通过SDS-PAGE证实两种酶在20分钟即有明显表达，因此确定后续实验采用45°C诱导20分钟。水凝胶基质由海藻酸钠（sodium alginate, SA）、聚吡咯（polypyrrole, PPy）和Mn²⁺交联形成。Mn²⁺既作为交联剂，也作为STING通路激动剂；PPy赋予水凝胶优异的近红外二区（NIR-II）光热转换能力。
通过扫描电子显微镜（SEM）确认水凝胶具有三维网络结构且细菌被成功封装。流变学测试显示EBPH在1%应变范围内保持线性黏弹性，且具有剪切变稀特性，表明其可注射性良好。在1064 nm激光照射下，EBPH温度可迅速升高31.5°C，光热转换效率达40.7%。通过循环照射策略，水凝胶温度可维持在42–50°C之间，从而保证热敏启动子持续激活但不损伤细菌活性。酶动力学分析显示，细菌表达的LOX和GOX的米氏常数（Michaelis constant, Km）分别为2.53 mM和3.44 mM，与游离酶相当。此外，EBPH在催化葡萄糖和乳酸降解过程中可产生过氧化氢，后者被Mn²⁺转化为氧气，从而提高溶解氧含量，有助于缓解肿瘤缺氧。
（二）体外抗肿瘤效果与代谢调控实验
以CT26小鼠结直肠癌细胞为模型，通过MTT实验和活/死细胞染色评估EBPH的细胞毒性。结果显示，在无激光照射时，水凝胶和细菌封装水凝胶对细胞活力影响极小；激光照射后，共表达LOX和GOX的EBPH（L&G in EBPH）表现出最强细胞毒性。Annexin V-FITC/PI凋亡检测表明，L&G in EBPH加激光组凋亡率最高。活性氧（ROS）检测显示该组ROS水平显著升高，其机制为酶催化产生的H₂O₂在Mn²⁺和酸性环境下转化为毒性更强的羟基自由基（·OH）。同时，谷胱甘肽（GSH）水平显著下降，进一步削弱了肿瘤细胞的抗氧化能力。
在免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD）方面，L&G in EBPH加激光组HMGB1、钙网蛋白（calreticulin, CRT）和ATP的释放均显著增加，表明该系统可有效诱导ICD。此外，Mn²⁺释放激活了cGAS/STING通路，RT-PCR结果显示CXCL9、CXCL10、IFNB1和ISG56的mRNA水平明显上调，Western blot证实STING、TBK1、IRF3及p-IRF3蛋白表达增强。
代谢调控方面，L&G in EBPH加激光可同时降解葡萄糖和乳酸，降低两者的浓度。NADP⁺/NADPH比值显著升高，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）活性降至最低，表明磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway, PPP）被有效抑制。此外，L&G in EBPH可下调缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）并缓解细胞缺氧。利用Seahorse分析仪检测细胞糖酵解速率和线粒体应激，结果显示基础糖酵解和代偿性糖酵解均被显著削弱，而线粒体基础呼吸和ATP生成则有所增加，表明细胞代谢由糖酵解向氧化磷酸化转变。蛋白质组学分析进一步证实了碳水化合物代谢、碳代谢和氨基酸生物合成等通路的显著调控。
（三）体内抗肿瘤与免疫评价
建立CT26荷瘤BALB/c小鼠模型，随机分为7组。EBPH注射于肿瘤周围，1064 nm激光照射以诱导酶表达。结果显示，L&G in EBPH加激光组原发肿瘤和远端肿瘤体积均显著抑制，肿瘤重量最低，生存期明显延长。H&E、TUNEL和Ki67染色证实该组肿瘤细胞凋亡和增殖抑制最为显著。细菌分布分析显示细菌主要富集于肿瘤部位，正常组织中72小时内被清除，血液生化指标和体温监测均未发现明显毒性。
代谢调控方面，体内实验同样证实L&G in EBPH加激光可显著降低肿瘤内葡萄糖和乳酸浓度，抑制G6PDH活性并降低GSH水平。免疫评价方面，流式细胞术和免疫荧光染色显示该组CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润显著增加，肿瘤相关巨噬细胞向M1表型极化增强，树突状细胞成熟比例升高，调节性T细胞减少。脾脏中记忆T细胞比例增加，提示形成长期免疫记忆。血清细胞因子检测显示促炎因子IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α显著升高，而抗炎因子IL-4和IL-10明显下降，表明免疫抑制微环境得到有效逆转。
四、研究结论与意义
本研究成功构建了一种基于AND门逻辑的工程化活性水凝胶系统EBPH。该系统以热敏启动子控制LOX和GOX的共表达作为两个“高”输入，以NIR-II激光作为触发开关，通过降解葡萄糖和乳酸实现肿瘤能量代谢重编程，抑制糖酵解并促进线粒体氧化磷酸化，同时缓解肿瘤缺氧。代谢调控进一步诱导ICD、激活cGAS/STING通路、增强T细胞浸润和巨噬细胞M1极化、减少调节性T细胞，最终实现“高”输出的抗肿瘤免疫治疗。该研究为工程化活性材料在肿瘤代谢调控与免疫治疗中的协同应用提供了新思路，具有潜在的临床转化价值，尤其适用于结直肠癌、胃癌和肝癌等可通过NIR-II激光照射的实体肿瘤。
五、研究亮点
本研究的亮点在于：其一，利用AND门逻辑设计实现了双酶时空可控共表达，提高了代谢调控的精准性；其二，将光热水凝胶与工程化细菌结合，实现了“光触发—酶表达—代谢调控—免疫激活”的级联治疗策略；其三，通过代谢调控与免疫治疗的协同作用，不仅抑制了原发肿瘤，还诱导了远端肿瘤抑制和长期免疫记忆，展现了良好的全身性抗肿瘤效应。