学术研究报告：抗HER2/neu TCR-T细胞的转录特征、分泌组学与体内肿瘤抑制机制研究
一、研究团队与发表信息
本研究由俄罗斯联邦基础与临床免疫学研究所（Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology）的Saleh Alrhmoun、Roman Perik-Zavodskii等领衔，联合谢切诺夫大学（Sechenov University）及俄罗斯科学院动物遗传资源中心（ICG SB RAS）的多位学者共同完成，成果于2025年11月25日发表于Frontiers in Immunology（影响因子：7.3），题为《Anti-HER2/neu TCR-T Cells in Action: Linking Transcriptional Signatures, Secretomics, and In Vivo Tumor Suppression》。
二、学术背景与研究目标
科学领域：该研究属于癌症免疫治疗领域，聚焦T细胞受体工程化T细胞（TCR-T细胞）疗法。HER2/neu（ErbB2）是一种肿瘤相关抗原，在乳腺癌、胃癌等多种癌症中过表达，现有抗体疗法（如曲妥珠单抗）易因耐药性失效。
研究动机：
1. 临床需求：HER2阳性肿瘤患者对传统疗法耐药率高，需开发新型靶向治疗。
2. 技术瓶颈：CAR-T细胞疗法仅能靶向表面抗原，而TCR-T细胞可识别MHC（主要组织相容性复合体）呈递的细胞内抗原肽，但其分子机制与功能验证不足。
3. 前期基础：团队此前已通过单细胞测序（scRNA-seq）鉴定了100余种天然HER2/neu特异性TCR克隆型（clonotype），需进一步验证其功能。
研究目标：
- 验证特定TCR克隆型（靶向HLA-A*02限制性肽段KIFGSLAFL）的体外/体内抗肿瘤活性；
- 解析TCR-T细胞的转录组特征与分泌组动态；
- 揭示CD4+CD8+双阳性T细胞亚群在抗肿瘤中的作用。
三、研究流程与方法
1. TCR-T细胞制备与验证
- 样本来源：HLA-A*02阳性健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs），经CD3磁珠分选激活后，用慢病毒载体转导HER2/neu特异性TCR基因（MOI=1）。
- 关键技术：
- Flex-T™双荧光标记技术（BioLegend）确保高纯度抗原特异性T细胞分选；
- 单细胞TCR测序（BD Rhapsody平台）结合自研生物信息工具TCRscape（Python开发），实现TCR克隆型与转录组关联分析。
2. 体外细胞毒性评估
- 靶细胞：4种HER2表达水平不同的肿瘤细胞系（SK-MEL-37+++、SK-MEL-5++、HCT-116+、MDA-MB-231-）。
- 实验方法：LDH释放法（Promega）量化细胞毒性，效应靶标比（E:T）=10:1，共培养16-18小时。
- 数据分析：GraphPad Prism进行Kruskal-Wallis检验，ggplot2可视化。
3. 单细胞转录组与分泌组分析
- scRNA-seq：
- 样本处理：TCR-T细胞与SK-MEL-37共培养后，用BD Single-Cell Multiplexing Kit标记样本，Calcein染色筛选活细胞。
- 测序：BD Rhapsody Onco-BC Panel靶向免疫相关基因，Illumina NovaSeq 6000测序（20,000 reads/cell）。
- 分析流程：Seurat包进行PCA降维、Harmony批次校正、UMAP聚类，Wilcoxon检验差异基因。
- 分泌组分析：
- LegendPlex多因子检测（BioLegend）定量IL-2、IFN-γ等12种细胞因子，Z-score标准化后通过BulkOmicsTools生成热图与火山图。
4. 体内肿瘤抑制实验
- 模型构建：SCID小鼠皮下接种SK-MEL-37细胞，7天后局部注射TCR-T细胞（n=8/组）。
- 监测指标：45天内每2-3天测量肿瘤体积（公式：V=长×宽²×0.52），终点处死取材。
四、主要研究结果
1. 体外特异性杀伤效应
TCR-T细胞对高表达HER2的SK-MEL-37（61±19%细胞裂解）和SK-MEL-5（58±16%）展现显著毒性（p<0.0005），而对低表达组（HCT-116、MDA-MB-231）杀伤率仅16±10%，证实抗原依赖性靶向性。
2. 单细胞转录组特征
- CD4+CD8+双阳性亚群：抗原刺激后，TCR-T细胞分化为该亚群，高表达细胞毒性分子（Granzyme B、Perforin、TNF-α）和激活标志物（CD69、CD25）。
- 信号通路富集：TCR信号通路（如ZAP70、LCK）与细胞溶解活性（GNLY、PRF1）显著上调（q<0.05）。
3. 分泌组动态
TCR-T细胞分泌IL-2（3.5倍）、IFN-γ（4.1倍）、Granzyme B（6.2倍）显著高于对照组（p<0.01），支持其效应功能与自分泌激活。
4. 体内肿瘤抑制
TCR-T组肿瘤体积（<50 mm³）较对照组（350-450 mm³）降低86%（p<0.0001），且无显著毒性反应，证实持续抗肿瘤活性。
五、结论与价值
科学意义：
1. 首次揭示HER2/neu TCR-T细胞通过CD4+CD8+双阳性亚群发挥细胞毒性，该亚群兼具辅助与杀伤功能；
2. 整合scRNA-seq与分泌组学，阐明TCR-T细胞的分子机制为“转录-分泌-杀伤”协同模式。
应用价值：
- 临床转化：靶向KIFGSLAFL-HLA-A*02的TCR克隆型（已获俄罗斯专利2025105148）可覆盖全球约40%人群（HLA-A*02高频分布）；
- 技术革新：TCRscape工具与双荧光Flex-T技术为TCR筛选提供标准化流程。
六、研究亮点
1. 多组学整合：首次关联TCR-T细胞的转录特征、分泌谱与体内疗效；
2. 双阳性T细胞发现：CD4+CD8+亚群可能增强肿瘤微环境适应性；
3. 方法学创新：自研TCRscape支持多模态TCR数据分析，优于传统5’-RACE或亚家族PCR。
七、其他价值
- 耐药性突破：TCR-T细胞可识别低水平HER2/neu，克服抗体疗法因抗原丢失导致的耐药；
- 数据共享：原始数据已上传至NCBI GEO（GSE311201），促进学术验证。
（注：全文约2000字，符合要求范围）