在theranostics期刊2023年第13卷第12期，由Maria Vlastara, Raffaella Rossin, Freek J.M. Hoeben, Kim E. de Roode, Milou Boswinkel, Laurens H.J. Kleijn, James Nagarajah, Mark Rijpkema及通讯作者Marc S. Robillard（来自Tagworks Pharmaceuticals, Symo-chem和Radboud大学医学中心核医学科的研究团队）共同发表了一篇题为《Click-to-Release: Cleavable Radioimmunoimaging with [89Zr]Zr-DFO-Trans-Cyclooctene-Trastuzumab Increases Tumor-to-Blood Ratio》的原创研究论文。
这项研究的学术背景集中于核医学与分子影像学领域，特别是正电子发射断层扫描（PET）免疫成像中长久存在的一个核心挑战。使用锆-89（89Zr）标记的单克隆抗体（mAbs）进行PET成像时，由于抗体在血液循环中存留时间过长，导致高背景信号，降低了图像对比度。为了解决这一限制，研究团队的目标是开发一种能够选择性清除血液中放射性信号的新方法。传统方案，如使用抗体片段或预靶向策略，存在肿瘤摄取降低、操作复杂或导致肝脏放射性滞留等问题。本研究引入了一种基于生物正交化学的“点击释放”（Click-to-Release）策略。其基本原理是：先注射一种标记有反式环辛烯（TCO）连接子并偶联了放射性螯合剂（DFO-89Zr）的靶向抗体（曲妥珠单抗，Trastuzumab）。在抗体于肿瘤部位积累并内化后，再注射一种名为四嗪（Tetrazine）的“触发剂”。该触发剂能在血液等细胞外区域与TCO发生快速、特异性的生物正交反应，导致放射性螯合物从抗体上被切割下来。被释放的小分子片段可通过肾脏快速清除，从而降低血液背景放射性，同时已内化到肿瘤细胞内的放射性则被保留，最终实现肿瘤与血液（T/B）比率的显著提高。
该研究的详细工作流程严谨且系统，可分为以下主要步骤：
首先，研究人员设计并合成了一系列具有不同亲水性和结构的TCO-DFO连接子-螯合剂构建体。这些构建体通过在TCO连接子的两端引入不同长度的聚乙二醇（PEG）间隔基来调节性能，旨在优化后续的点击释放反应效率。所有构建体均与靶向HER2受体的曲妥珠单抗成功偶联，形成TCO-Tmab偶联物，并进一步用89Zr进行放射性标记，获得高纯度的[89Zr]Zr-TCO-Tmab探针。在体外稳定性测试中，这些探针在人血清和小鼠血清中均表现出长达4天的良好稳定性。
其次，研究团队在体外评估了不同四嗪触发剂诱导放射性片段释放的效率。他们测试了包括高反应性但药代动力学较快的3,6-二甲基四嗪，以及新开发的、旨在提高释放效率的邻位功能化吡啶基四嗪（化合物10）。通过将[89Zr]Zr-TCO-Tmab与过量的触发剂在磷酸盐缓冲液（PBS）和50%小鼠血浆中孵育，并使用尺寸排阻色谱（SEC）分析释放率，他们筛选出了性能最优的配对：[89Zr]Zr-Tmab-8（具有前后PEG间隔基的构建体）与触发剂10。该组合在50%小鼠血浆中实现了高达83%的放射性片段释放率，接近理论最大值。
第三，研究转向体内评估。首先在无瘤健康小鼠中确定了触发剂的最佳剂量（33.4 µmol/kg），并证明了单次触发剂注射即可有效清除血液循环中绝大部分的TCO修饰抗体，二次注射未见额外清除效果，表明首次注射已近乎完全反应。同时，他们测定了[89Zr]Zr-Tmab-8上TCO连接子在体内的失活半衰期长达16.5天，这为触发剂的注射时间窗口提供了极大的灵活性。此外，他们还在HER2阳性的BT-474癌细胞上研究了[89Zr]Zr-Tmab-8的结合与内化动力学，发现6小时和24小时后，分别有约74%和91%的放射性抗体与细胞结合，其中绝大部分已内化（表面残留仅17.4%和9.9%）。这为在体内选择触发剂注射时间点（6小时或24小时后）提供了依据，以确保肿瘤细胞已充分内化抗体，避免肿瘤内放射性被触发剂清除。
第四，在携带BT-474异种移植瘤的小鼠模型中，他们进行了关键的疗效验证实验。小鼠被注射[89Zr]Zr-Tmab-8后，分别在6小时或24小时注射触发剂10，并在触发剂注射4小时后处死小鼠进行生物分布分析。实验设置了未接受触发剂的对照组。结果显示，触发剂的注射显著降低了血液、肝脏、肺等组织的放射性水平。当触发剂在抗体注射后6小时给予时，肿瘤与血液比率（T/B）从对照组的1.0 ± 0.4显著提升至2.3 ± 0.6；当在24小时后给予时，T/B比率从对照组的2.5 ± 0.7跃升至6.6 ± 0.9。这表明，无论是在早期还是较晚期进行触发，点击释放策略都能有效提高图像对比度，且较晚触发（允许更多肿瘤内化）能获得更优的T/B比。
第五，为了直观展示该方法对成像质量的改善，研究团队进行了小动物PET成像研究。小鼠在注射[89Zr]Zr-Tmab-8后5小时（注射触发剂前）进行第一次PET扫描（Scan 1），此时图像显示高血本底，肿瘤与心脏的放射性比值仅为0.9 ± 0.1，肿瘤显影模糊。在抗体注射后6小时给予触发剂10，并于触发后4小时进行第二次PET扫描（Scan 2）。图像对比发生惊人变化：血液本底放射性大幅降低，肿瘤与心脏比值提升至2.4 ± 0.7，肿瘤轮廓变得异常清晰。PET图像清晰地显示，被释放的放射性小片段主要通过肾脏进入膀胱排泄。
该研究的主要结论是：首次在活体小鼠中成功利用反式环辛烯-四嗪点击释放化学，实现了放射性螯合剂从单克隆抗体上的高效、时空调控切割。这种方法提供了优异的脱靶失活效果，能快速通过肾脏清除被切割的放射性片段，同时基本保留了肿瘤内的靶向活性。这为改善基于全抗体的PET成像提供了强有力的新工具。
本研究的科学价值和应用潜力十分显著。其科学价值在于将前沿的生物正交点击释放化学创造性地应用于核医学成像领域，为解决抗体长循环半衰期导致的高本底难题提供了一个全新的、原理上截然不同的解决方案。从应用角度来看，该方法有望带来多重益处：1）大幅缩短注射放射性抗体与进行PET扫描之间的等待时间，从目前的4-7天缩短至同一天内完成（即“同日成像”），提高患者周转率和就医体验；2）降低患者的全身辐射剂量，尤其是对骨髓等敏感器官的辐射暴露；3）显著提升图像质量和诊断信心。此外，作者展望该方法不仅适用于肿瘤成像，还可能用于提高旨在穿越血脑屏障的抗体在大脑成像中的信噪比，或改善其他靶向剂的靶向/非靶向比率。更重要的是，该策略在放射性免疫治疗领域具有巨大潜力，通过降低骨髓剂量，可能允许向肿瘤递送更高的治疗剂量。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先是方法的创新性，这是首次在活体内利用TCO-四嗪点击释放化学来释放放射性核素，概念新颖。其次是策略的巧妙性，它利用了抗体在肿瘤细胞内化速度快于血液清除的特点，通过非细胞渗透性的触发剂选择性清除细胞外（血液中）的放射性，而保留已进入细胞内的信号。第三是验证的全面性，研究从分子设计、体外筛选、体内药代动力学、肿瘤模型生物分布到最终PET成像，形成了一个完整、严谨的证据链。第四是结果的显著性，在肿瘤模型中，无论6小时还是24小时触发，都实现了T/B比成倍增长，PET图像改善效果一目了然。最后是广泛的应用前景，该方法不仅限于89Zr-曲妥珠单抗，其平台技术特性可扩展到其他放射性核素、其他靶向抗体乃至更小的靶向分子，为核医学诊断和治疗开辟了新路径。