研究报告：HIV-1感染者中循环单核细胞-血小板聚集体水平升高与病毒血症及sCD163水平增加相关
一、研究概况
本研究由梁华（Hua Liang）、段兆军（Zhaojun Duan）、李丹（Dan Li）等多位学者合作完成。主要研究机构包括中国疾病预防控制中心（China CDC）性病艾滋病预防控制中心传染病预防控制国家重点实验室及北京大学基础医学院微生物学系。该研究成果作为研究论文（research article）于2014年8月11日在线发表于《Cellular & Molecular Immunology》期刊（2015年第12卷，第435-443页）。
二、研究背景与目的
慢性炎症与免疫激活是HIV-1持续感染和疾病进展的核心特征。单核细胞作为先天免疫系统的重要组成部分，其激活状态可通过多种标志物进行评估。外周血单核细胞根据CD14和CD16的表达可分为三个功能各异的亚群：经典型（CD14高表达CD16阴性，CD14highCD16⁻）、中间型（CD14高表达CD16阳性，CD14highCD16⁺）和非经典型（CD14低表达CD16阳性，CD14dimCD16⁺）。已有研究表明，在HIV-1感染者中，非经典型和中间型单核细胞比例会增加。
另一方面，单核细胞-血小板聚集体（monocyte–platelet aggregates, MPAs）被认为是比血小板表面P-选择素（P-selectin, CD62P）更为敏感的血小板活化标志物，且与血栓栓塞事件和心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）风险高度相关。MPA的形成主要依赖于单核细胞表面的P-选择素糖蛋白配体-1（P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1）与活化的血小板表面CD62P的相互作用。已知HIV-1感染者的心血管疾病风险增加，但此前对于未接受抗逆转录病毒治疗的急性和慢性HIV-1感染者体内MPA水平、其在不同单核细胞亚群中的分布，以及MPA形成与单核细胞免疫激活状态之间的关系尚不明确。
因此，本研究旨在系统性地探讨HIV-1感染者（包括急性期和慢性期，且均未接受治疗）中三个单核细胞亚群的分布、MPA的形成水平、单核细胞的表型特征，并着重分析MPA水平与HIV-1病毒载量及单核细胞免疫激活标志物之间的关联，以期为理解HIV-1感染中单核细胞相关的免疫激活/炎症状态和血栓栓塞风险提供新的见解。
三、研究流程与方法
本研究主要包含以下步骤：
研究对象入组与分组：研究共招募了58名HIV-1感染者，均来自北京朝阳区的一个男男性行为者队列，且均为未接受抗病毒治疗的初治患者（treatment naive）。这58名感染者被划分为两组：急性HIV-1感染组（primary HIV-1 infection, PHI）38人，定义为在12个月内从末次抗体阴性转为阳性；慢性HIV-1感染组（chronic HIV-1 infection, CHI）20人，定义为确诊感染超过3年。同时，研究还招募了26名健康男性作为对照组（healthy controls, HC）。所有参与者均签署了知情同意书。研究对感染者进行了CD4⁺ T细胞计数和血浆HIV-1 RNA病毒载量的测定。
单核细胞亚型及MPA水平的流式细胞术测定：采集所有受试者的EDTA抗凝外周血。为测定MPA，将全血与荧光标记抗体组合（CD3-Pacific Blue, CD14-PE-Cy7, CD16-APC-Cy7, CD61-APC）共染色。为分析单核细胞表型，使用了包括PSGL-1、CD163、TLR2、TLR4、PD-L1和PD-1在内的多种抗体。样本经过红细胞裂解、洗涤和固定后，使用能够进行9色检测的FACSAria流式细胞仪进行采集，并使用FlowJo软件进行数据分析。单核细胞亚群通过CD14和CD16的表达来界定，MPA则由CD61阳性的单核细胞（CD61⁺单核细胞）来代表，表型标志物的表达水平以平均荧光强度（mean fluorescence intensity, MFI）表示。
血浆可溶性标志物检测：收集所有受试者的血浆样本，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，按照制造商的说明，定量检测血浆中可溶性CD14（sCD14）和可溶性CD163（sCD163）的水平。
数据统计分析：采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。组间比较使用非参数Mann-Whitney U检验。相关性分析则采用Pearson检验，评估CD4计数、病毒载量、单核细胞亚群比例、MPA百分比与单核细胞表型标志物MFI之间的相关性。p值小于0.05视为具有统计学意义。
四、主要研究结果
1. HIV-1感染改变单核细胞亚群的频率 研究发现，与健康对照组相比，HIV-1感染者的非经典型（CD14dimCD16⁺）和中间型（CD14highCD16⁺）单核细胞比例在PHI和CHI组均显著升高，而经典型（CD14highCD16⁻）单核细胞比例则显著下降。在PHI组中，非经典型和中间型单核细胞的比例与CD4⁺ T细胞计数呈负相关，而CHI组中未发现此相关性。
2. HIV-1感染期间所有三个单核细胞亚群的MPA形成均增加 结果显示，与健康对照组相比，PHI组中所有三个单核细胞亚群的MPA水平均显著升高。而在CHI组中，仅非经典型和中间型单核细胞的MPA水平显著升高，经典型单核细胞的MPA水平未达到统计学差异。更重要的是，在非经典型和中间型单核细胞中，MPA水平与HIV-1血浆病毒载量呈正相关，表明活跃的病毒复制与更高的MPA形成有关。此外，研究发现PSGL-1在所有三个单核细胞亚群上的表达在PHI组均显著降低，在CHI组部分恢复但仍低于正常。关键的是，PSGL-1的表达水平与MPA水平在所有单核亚群中均呈负相关，提示在MPA形成过程中，PSGL-1可能从单核细胞表面脱落。
3. HIV-1感染中单核细胞亚群的免疫激活标志物改变 对单核细胞表型的分析显示，在PHI组中，TLR2、TLR4和PD-L1在所有三个单核细胞亚群上的表达均显著上调。尽管在CHI组中这些标志物的表达有所下降，但仍显著高于健康对照组，表明慢性期免疫激活状态持续存在。而PD-1的表达升高仅见于非经典型单核细胞亚群。
4. 血浆sCD14和sCD163水平升高并与疾病进展相关 血浆检测显示，PHI和CHI组的sCD14和sCD163水平均显著高于健康对照组。值得注意的是，CHI组的sCD163水平较PHI组进一步显著升高。相关分析证实，血浆sCD14和sCD163水平与病毒载量正相关，与CD4⁺ T细胞计数负相关，表明这些标志物可作为疾病进展的预测指标。
5. MPA形成与单核细胞上CD163表达及血浆sCD163水平的不同关联 研究进一步揭示了免疫激活与MPA形成之间的紧密联系。首先，PSGL-1的表达与血浆sCD163水平在所有三个单核细胞亚群中均呈负相关。与此一致，所有三个单核细胞亚群的MPA水平均与血浆sCD163水平呈正相关。有趣的是，尽管膜CD163表达与血浆sCD163水平在此研究中未观察到负相关，但MPA水平却与各单核细胞亚群上的膜CD163表达呈负相关。这组复杂的关联表明，免疫激活状态加剧（血浆sCD163升高）与MPA形成增加密切相关，MPA的形成可能导致膜CD163分子的脱落或内化，从而使其表面表达下降。
五、研究结论与价值
本研究首次系统地描述了未接受抗病毒治疗的急性和慢性HIV-1感染者中，不同单核细胞亚群上MPA的水平。主要结论如下：HIV-1感染导致所有三个单核细胞亚群的MPA水平均升高，且这种升高在非经典型和中间型单核细胞中与病毒载量直接相关。升高的MPA水平与单核细胞激活状态增强以及PSGL-1和CD163表达下降相关。
该研究的科学价值在于：揭示了HIV-1感染中单核细胞-血小板之间的相互作用（crosstalk）的新机制，将单核细胞亚群分布、MPA形成与系统免疫激活标志物（sCD163）紧密联系起来。其应用价值在于：提示循环中的MPA水平可作为预测HIV-1感染者心血管疾病风险的一个有用的替代标志物（surrogate marker）。研究结果暗示，HIV复制、单核细胞活化与MPA形成之间的协同作用可能是导致HIV-1感染者血栓形成和心血管疾病风险增高的一个重要机制，为未来针对此通路的干预治疗（如抗血小板或抗炎治疗）提供了潜在的靶点。
六、研究亮点