DeepPhospho：基于深度学习的磷酸化蛋白质组学DIA数据分析新方法

作者及发表信息
本研究由上海科技大学的娄荣辉（Ronghui Lou）、刘伟珍（Weizhen Liu）等共同完成，通讯作者为上海科技大学的何旭明（Xuming He）和水文青（Wenqing Shui）。研究成果于2021年发表在*Nature Communications*期刊（DOI: 10.1038/s41467-021-26979-1）。

学术背景
磷酸化是一种关键的翻译后修饰（PTM），调控细胞信号网络的几乎所有功能。质谱（MS）技术是研究磷酸化修饰的核心工具，但传统的数据依赖性采集（DDA, Data-Dependent Acquisition）方法存在通量低、重复性差等问题。数据非依赖性采集（DIA, Data-Independent Acquisition）技术虽能提高定量准确性，但其数据分析严重依赖实验构建的谱图库（spectral library），而后者通常需通过DDA实验生成，耗时耗力且覆盖度有限。

本研究旨在开发一种基于深度学习的算法DeepPhospho，通过计算机模拟（in silico）生成磷酸化肽段的谱图库，从而绕过DDA实验，实现高效、高覆盖度的DIA磷酸化蛋白质组学分析。

研究流程与方法
1. DeepPhospho模型设计与训练
- 模型架构：采用混合神经网络设计，结合双向长短期记忆网络（Bi-LSTM）和Transformer模块。Bi-LSTM编码肽段序列的局部特征，Transformer捕获长程依赖关系，最终通过回归网络预测磷酸化肽段的碎片离子强度（fragment ion intensity）和保留时间（indexed retention time, iRT）。
- 训练数据：使用4个大规模磷酸化蛋白质组数据集（包括小鼠脑组织、人细胞系等）进行预训练，并在3个独立数据集（RPE1、U2OS细胞系）上微调模型。
- 创新点：首次引入Transformer结构预测磷酸化肽段谱图，并设计针对磷酸化修饰的特异性损失函数（如忽略磷酸基团不可存在的离子）。

1. 谱图库构建与验证

   • 生成7类谱图库：包括实验DDA库（Lib 1）、模拟DDA库（Lib 2）、混合库（如Lib 7，结合实验DIA库与公共数据库预测库）。
     
   • 性能评估：
     
     • 预测准确性：DeepPhospho预测的谱图与实验谱图的皮尔逊相关系数（PCC）中位数达0.968（RPE1 DDA数据），优于现有工具（如pDeep2、MS2PIP）。
       
     • 合成肽段验证：7条合成磷酸化肽段的预测谱图与真实谱图高度一致（PCC 0.79–0.97），而实验DIA库的谱图相关性较低（PCC −0.61–0.20）。
       

2. DIA数据分析应用

   • 覆盖度提升：在U2OS细胞数据中，Lib 7（基于公共数据库的预测库）比传统DDA库（Lib 1）多鉴定32,511个磷酸化肽段（增加26%）。
     
   • 信号通路研究：在EGF刺激的RPE1细胞实验中，Lib 7发现更多调控磷酸化位点（如128个新增EGF依赖位点），并显著富集mTOR、MAPK等通路（传统库仅富集1条通路）。
     
   • 定量准确性：在酵母-人混合蛋白质组模型中，预测库的定量误差中位数为7.56–8.18%，与传统库相当（7.82%）。
     

主要结果与逻辑关联
1. 模型性能验证：DeepPhospho在多个数据集上均表现出高预测精度（图1b-c），且能纠正实验库中的错误鉴定（图2）。
2. 覆盖度与效率：基于公共数据库的预测库（如Lib 7）显著提升磷酸化位点鉴定数量（图3c），同时通过迭代搜索策略（iterative search）进一步增加可定量肽段（图4d）。
3. 生物学意义：在EGF信号研究中，新增调控位点揭示了更多激酶（如Akt1、PAK1）和通路（如PKC）的参与（图5e-f），凸显了深度覆盖的价值。

结论与价值
1. 科学价值：
- 首次将Transformer架构应用于磷酸化肽段预测，解决了传统方法对肽段长度和修饰处理的局限性。
- 提出“仅需DIA数据+公共数据库”的全新工作流程，省去DDA实验，将分析时间从数月缩短至数天。
2. 应用价值：
- 为临床癌症组织（如磷酸化蛋白质组特征分析）和药物靶点发现（如抗病毒药物筛选）提供高效工具。
- 开源Web服务器（http://shuilab.ihuman.shanghaitech.edu.cn/deepphospho）支持用户自定义模型训练与库生成。

研究亮点
1. 方法创新：混合神经网络设计兼顾局部与全局特征，预测精度显著优于现有工具。
2. 流程革新：首次实现完全基于DIA数据和公共数据库的磷酸化蛋白质组分析，突破传统DDA库的瓶颈。
3. 生物学发现：通过深度覆盖揭示了更多EGF信号通路的调控机制，如MEK非依赖性磷酸化事件。

其他价值
DeepPhospho的框架可扩展至其他修饰（如乙酰化）或全局蛋白质组学，为PTM研究提供通用解决方案。