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卵巢癌生物标志物HE4的DNA适配体筛选：基于CE-SELEX与高通量测序技术的研究

一、作者与发表信息
本研究由Rachel M. Eaton、Jamie A. Shallcross等来自Oberlin College化学与生物化学系的研究团队完成，发表于Analytical and Bioanalytical Chemistry期刊（2015年4月，卷407，页6965–6973）。研究通过美国国家癌症研究所（R15CA161970）和Henry Dreyfus教师学者奖资助。

二、学术背景
卵巢癌的早期诊断对患者生存率至关重要。局部病变的5年生存率达92%，而转移后仅27%。目前临床常用标志物CA125存在假阳性率高的问题，而HE4（人附睾蛋白4）因其在卵巢癌组织中的高表达和血清检测特异性成为潜在替代标志物。然而，现有抗体检测技术存在成本高、稳定性差等局限。
本研究旨在通过毛细管电泳-系统进化配体富集技术（CE-SELEX）结合高通量测序（HTS），筛选出高亲和力的DNA适配体（aptamer），以开发新型HE4检测方法。适配体作为核酸探针，具有易标记、稳定性高、可体外合成等优势。

三、研究流程与方法
1. CE-SELEX筛选
- 文库设计：初始文库为含25个随机碱基的单链DNA（ssDNA），理论多样性达4²⁵（约10¹⁵种序列），实际投入100 pmol（约6×10¹³分子）。
- 靶标蛋白：使用带GST标签的重组HE4（HE4-GST），并通过阴性筛选（以纯GST为靶标）去除非特异性结合序列。
- 筛选条件：共5轮正筛选（R1-R5）和2轮负筛选（R2⁻、R3⁻），逐步降低HE4浓度（50 nM→0.5 nM）并提高DNA竞争性（10 μM→300 nM）。
- 毛细管电泳分离：在Tris-甘氨酸缓冲液（pH 8.3）中，通过高电场（25 kV）分离DNA-蛋白复合物与游离DNA，收集结合组分。

1. PCR扩增与单链化

   • 优化循环数：通过凝胶电泳确定最佳PCR循环数（避免副产物），扩增后经链霉亲和素柱纯化单链DNA。
     
   • 防污染措施：使用无核酸酶试剂，并通过紫外吸收（260 nm）定量DNA。
     

2. 高通量测序与生物信息学分析

   • 测序平台：Illumina测序，每轮产生数百万条序列（平均6.4×10⁶条）。
     
   • 数据分析流程：
     
     • 去冗余：去除引物序列和适配体污染（如Illumina索引适配器）。
       
     • 富集分析：通过自研Python脚本（enrichment.py）计算各序列在筛选轮次中的富集倍数（fold enrichment），优于传统克隆测序的读计数统计。
       
     • 聚类分析：使用CD-HIT-EST（序列相似性阈值80%）识别共有基序，筛选代表性候选适配体（如A1、A3、B10等）。
       

3. 亲和力验证实验

   • 亲和探针毛细管电泳（APCE）：检测适配体与HE4-GST的结合，通过游离DNA峰高变化计算解离常数（Kd）。
     
   • 荧光各向异性（FA）：标记Texas Red荧光基团的适配体与HE4结合后，偏振信号变化反映结合强度。
     

四、主要结果
1. 筛选效率：
- 高通量测序显示，富集序列的比例从初始库的10%提升至R5的40%，证实CE-SELEX的有效性。
- 阴性筛选成功去除非特异性结合GST的序列（如对照序列L1在GST检测中无结合）。

1. 候选适配体特性：

   • A1：R5中最富集序列（富集倍数26），Kd（APCE）=390 nM，MPbind评分（z-score=10.75）表明高亲和潜力。
     
   • B10：26碱基序列（超出设计长度），但Kd（FA）=280 nM，显示独特结合特性。
     
   • D3：早期筛选序列（R2）亲和力低（Kd=26 μM），说明多轮筛选的必要性。
     

2. 方法学优势：

   • 与传统克隆测序相比，HTS可识别低丰度高亲和力序列（如A3虽富集倍数较低，但属于最大聚类簇）。
     
   • APCE与FA结果一致性较高（如A1的Kd差异在2倍内），验证了数据的可靠性。
     

五、结论与价值
本研究首次将CE-SELEX与HTS结合应用于HE4适配体筛选，成功获得纳摩尔级亲和力的DNA适配体（如B10）。其科学价值在于：
1. 方法学创新：通过生物信息学分析全程监控筛选进程，避免了传统SELEX的“盲选”局限。
2. 临床应用潜力：适配体可替代抗体用于卵巢癌早期诊断，尤其适用于HE4与CA125联检（如ROMA算法）。

六、研究亮点
1. 技术整合：CE的高效分离与HTS的大数据覆盖结合，显著提升筛选效率。
2. 开源工具：研究公开了enrichment.py脚本（GitHub），促进同类研究的数据分析标准化。
3. 质量控制：通过阴性筛选和MPbind评分双重验证，降低假阳性风险。

七、后续方向
作者计划改进PCR步骤（如采用乳液PCR），并尝试以His标签替换GST标签的HE4蛋白，以进一步提升适配体亲和力。此外，引入二价离子可能增强适配体结构多样性。

该报告全面覆盖了研究的背景、方法、结果与意义，尤其突出了技术整合与数据分析的创新性，为核酸适配体在癌症诊断中的应用提供了重要参考。