本研究由牛津大学心血管医学部Marina Diotallevi教授、Keith Channon教授以及萨里大学Mark Crabtree教授共同领导，并由多机构团队合作完成。该研究成果以题为《iNOS以不依赖NO的方式通过与线粒体中IRG1直接相互作用调节炎症反应》的形式，以“Letter”格式发表于Nature Metabolism期刊，于2026年在线发表。
一、 研究背景与目的 本研究属于免疫代谢学领域，聚焦于巨噬细胞在炎症状态下的代谢重编程。诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）及其产物一氧化氮（NO）在巨噬细胞活化和功能调控中扮演核心角色，已知能驱动细胞代谢从氧化磷酸化向糖酵解转换。与此同时，衣康酸（itaconate）作为三羧酸循环衍生的代谢物，由免疫反应基因1（Immunoresponsive gene 1, IRG1，亦称ACOD1）催化产生，是炎症期间上调最显著的代谢物之一。衣康酸通过其亲电特性修饰多种关键蛋白（如ATF3， JAK1等）的胱氨酸残基，在调节巨噬细胞极化、糖酵解和抗氧化应激方面发挥重要作用。
一个引人注目的前期发现是，缺乏iNOS的巨噬细胞在受到炎症刺激时，其细胞内衣康酸水平较野生型细胞高出约15倍。这一现象暗示iNOS或NO可能深刻影响衣康酸的生物合成。然而，其具体调控机制尚不明确。传统上，iNOS的功能被归因于其催化产生的NO及其衍生的活性氮物种。本研究旨在深入探究iNOS如何调控IRG1活性及衣康酸水平。核心科学问题是：这种调控是通过iNOS产生的NO介导的，还是存在其他非经典机制？
因此，本研究的目标是：1）确认iNOS对IRG1活性和衣康酸产生的抑制作用；2）阐明这一抑制作用是否依赖于NO的产生；3）揭示iNOS调控IRG1的具体分子机制。
二、 详细研究流程 本研究设计严谨，整合了细胞生物学、生物化学、蛋白质组学、计算结构生物学和生物物理学等多层次方法，流程可概括为以下几个主要阶段：
第一阶段：表型确认与NO依赖性初探 * 研究对象与处理：使用野生型（WT）和iNOS基因敲除（iNOS-KO）小鼠的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）。细胞用脂多糖（LPS）和干扰素-γ（IFNγ）刺激不同时间点（0-30小时）。 * 实验与方法： 1. 代谢物测定：使用高效液相色谱（HPLC）定量细胞裂解液（细胞内）和培养基（细胞外）中的衣康酸水平。 2. NO与超氧化物检测：使用Griess法测定培养基中亚硝酸盐（NO代谢产物）积累；使用HPLC结合二氢乙啶探针检测细胞内超氧化物水平。 3. 蛋白表达分析：通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测IRG1蛋白水平。 * 关键对照与拓展：为了排除培养基养分耗竭等因素影响，补充了底物（顺乌头酸）水平、葡萄糖消耗、以及更换新鲜培养基等对照实验。同时，在缺乏iNOS辅因子四氢生物蝶呤（BH4）的GCH1-KO巨噬细胞中进行了蛋白质组学和代谢组学分析，以评估衣康酸分解代谢是否受影响。
第二阶段：在HEK293T细胞模型中验证与机制排除 * 研究对象与处理：利用不表达内源性iNOS和IRG1的人胚胎肾细胞（HEK293T），进行质粒转染。分别或共转染小鼠或人的iNOS（NOS2）和IRG1（ACOD1）cDNA。 * 实验与方法： 1. 功能验证：检测共转染iNOS和IRG1后，衣康酸和NO的产生变化。 2. 药理学干预：使用iNOS特异性抑制剂1400W和氨基胍（AG），以及NO供体（NOC18， SIN-1）处理转染细胞，观察对衣康酸产生的挽救或抑制效果。 3. 排除翻译后修饰： * 体外酶活实验：建立了HPLC检测法，使用从哺乳动物表达系统纯化的重组IRG1蛋白，在体外直接测试多种NO供体、亚硝酸盐、过氧化氢（H2O2）、谷胱甘肽等分子对IRG1酶活性的影响。 * 半胱氨酸突变体构建：构建了IRG1的六个单个半胱氨酸突变体（C184A， C340A， C387A， C432A， C452A）和一个五重突变体（Ala5），在HEK细胞中检验它们对iNOS抑制的敏感性。
第三阶段：探索蛋白质-蛋白质相互作用 * 研究对象与处理：使用LPS/IFNγ刺激后的WT和iNOS-KO小鼠BMDMs。 * 实验与方法： 1. 免疫共沉淀-质谱联用（Co-IP/MS）：使用IRG1抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀，然后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定与IRG1相互作用的蛋白质。以IgG作为对照。对差异蛋白进行生物信息学分析（STRING数据库）。 2. Co-IP验证：在WT细胞使用AG抑制剂处理、以及在GCH1-KO细胞（有iNOS蛋白但无NO产生）中，进行IRG1的免疫沉淀，随后用Western Blot检测沉淀物中是否存在iNOS，以验证相互作用是否依赖于iNOS的催化活性。 3. 亚细胞定位：通过细胞器分离技术分离线粒体和胞质组分，用Western Blot检测iNOS和IRG1的分布。同时，使用免疫荧光共聚焦显微镜，观察iNOS与线粒体标志物HSP60的共定位情况。
第四阶段：计算模拟与体外结合验证 * 研究方法： 1. 计算结构建模：利用AlphaFold-Multimer（v2.3）对小鼠和人的（IRG1）2–（iNOS）2异源四聚体复合物进行三维结构预测。建模时考虑了iNOS的辅因子（钙调蛋白、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、血红素）存在的情况。 2. 分子动力学模拟：对预测的复合物结构进行分子动力学模拟（每个体系3个重复，每次300纳秒），评估蛋白质-蛋白质界面的稳定性，并计算结合自由能（MM/GBSA方法）。 3. 表面等离子体共振（SPR）：将纯化的iNOS或IRG1蛋白固定在芯片上，以另一种蛋白作为分析物，精确测定两者之间的结合动力学参数（结合速率常数Ka、解离速率常数Kd、平衡解离常数KD）。同时测试了内皮型NOS（eNOS）作为阴性对照。
第五阶段：阐明iNOS构象与功能的关系 * 研究对象与处理： 1. iNOS点突变体：构建了针对iNOS中关键色氨酸残基（W457）的突变体（W457A和W457F）。该位点对BH4结合至关重要：W457A完全破坏BH4结合和NO产生；W457F部分保留BH4结合和约50%的NO产生能力。在HEK细胞中与IRG1共转染，测试其抑制衣康酸产生的能力。 2. 体外重组蛋白实验：将纯化的IRG1与不同比例的商业化纯化iNOS（预先结合BH4）在不含L-精氨酸及其他辅因子的条件下共同孵育，检测衣康酸产生。设置热灭活的iNOS作为对照。 3. 天然蛋白构象分析：使用蓝色非变性凝胶电泳（Blue Native PAGE）分析WT、GCH1-KO以及AG处理的WT巨噬细胞中iNOS蛋白的单体/二聚体比例。
三、 主要研究结果 结果1：iNOS抑制衣康酸积累，且与NO产生解耦联。 在BMDMs中，LPS/IFNγ刺激后，WT细胞产生大量NO，但其细胞内衣康酸水平在6小时后开始下降，而iNOS-KO细胞则持续积累衣康酸，至18小时时高出WT细胞15倍以上。细胞外衣康酸差异更为显著。IRG1蛋白水平在两者间无差异。在HEK细胞模型中，共转染iNOS能完全废除IRG1产生的衣康酸，但不影响iNOS自身的NO产量。关键发现是：iNOS抑制剂AG能完全恢复衣康酸水平并消除NO，而另一种抑制剂1400W仅部分减少NO，却能显著恢复衣康酸；外源性NO供体则无法抑制衣康酸产生。这强烈提示存在独立于NO的调控机制。
结果2：iNOS对IRG1的抑制不依赖于NO相关的翻译后修饰。 体外酶活实验证实，纯化的IRG1活性不受多种NO供体、亚硝酸盐、过氧化氢、还原/氧化型谷胱甘肽等分子的影响。此外，所有IRG1半胱氨酸突变体均能正常产生衣康酸，并且在共转染iNOS时其活性仍被完全抑制。这排除了iNOS通过产生NO或活性氧/氮物种对IRG1关键半胱氨酸进行翻译后修饰从而抑制其活性的可能性。
结果3：iNOS与IRG1在线粒体内发生直接相互作用。 Co-IP/MS分析发现，在WT巨噬细胞中，iNOS是IRG1最主要的结合蛋白之一（富集倍数>11），且该相互作用在iNOS-KO细胞中消失。生物信息学分析显示WT中与IRG1互作的蛋白多为线粒体相关蛋白（如MT-CO2， COX5A）。重要的是，在AG处理的WT细胞和GCH1-KO细胞中，iNOS仍能与IRG1发生共沉淀，证明这一相互作用不依赖于iNOS的催化活性。亚细胞定位实验证实，炎症刺激后，iNOS蛋白部分定位于线粒体，并与线粒体标志物HSP60共定位。
结果4：计算与实验证实iNOS-IRG1间存在高亲和力、进化保守的直接结合。 AlphaFold预测显示小鼠和人的iNOS二聚体与IRG1二聚体能够形成稳定的异源四聚体复合物，两者以近似垂直的角度结合。分子动力学模拟表明该结合界面在300纳秒内保持稳定，结合自由能计算显示强烈的结合倾向（约-152 kcal/mol）。SPR实验直接定量了这种相互作用：小鼠iNOS与IRG1的KD值为174 nM，人源蛋白的KD值为189 nM，表明这是一种高亲和力、进化上保守的特异性相互作用。eNOS则不能与IRG1结合。
结果5：iNOS抑制IRG1依赖于BH4结合的构象，而非其底物L-精氨酸或NO合成能力。 功能实验表明，iNOS突变体W457A（无NO产生）和W457F（部分NO产生）均无法抑制IRG1介导的衣康酸生成。这说明BH4与iNOS的结合是抑制IRG1所必需的。决定性证据来自体外实验：即使在完全缺乏L-精氨酸（即NO合成被彻底剥夺）的条件下，预先结合了BH4的活性iNOS蛋白仍能以剂量依赖的方式强烈抑制纯化IRG1的酶活性（1:1比例抑制>75%），而热灭活的iNOS则无此效果。这表明iNOS蛋白本身，在特定构象下，就足以直接抑制IRG1。
结果6：iNOS的动态二聚体构象是其抑制功能的关键。 蓝色非变性电泳显示，在WT巨噬细胞中iNOS主要以二聚体形式存在。在缺乏BH4的GCH1-KO细胞中，单体比例增加；而用AG处理后，iNOS几乎完全以二聚体形式存在。结合文献和计算结果，研究者提出一个模型：BH4作为“变构稳定剂”，促使iNOS形成并维持一种特定的、具有动态性的二聚体构象。这种构象是iNOS与IRG1结合并抑制其活性所必需的。AG可能通过将iNOS“锁定”在某种二聚体状态而阻止其与IRG1的有效相互作用，从而解除了抑制。
四、 结论与意义 本研究得出了一个突破性的结论：iNOS通过一种不依赖于其经典酶活产物NO的非经典机制，调节巨噬细胞的炎症代谢反应。其核心机制在于，iNOS在辅因子BH4的稳定下，形成特定的二聚体构象，并直接易位至线粒体，与IRG1蛋白发生高亲和力的蛋白质-蛋白质相互作用，从而直接抑制IRG1的酶活性，降低衣康酸的产生。
科学价值： 1. 颠覆了对iNOS功能的传统认知：将iNOS的角色从一个单纯的NO“合成酶”，扩展为一个处于氧化还原信号与代谢交叉点的“信号枢纽”。它既能通过产生NO行使功能，又能作为支架蛋白直接调控代谢酶。 2. 揭示了免疫代谢调控的新范式：提出了通过关键代谢酶之间的直接物理相互作用来快速、精确调控代谢通路的全新机制（PPI介导的代谢调控）。 3. 阐明了衣康酸水平差异的分子基础：解释了为何不同实验室或不同刺激条件下衣康酸水平报道差异巨大，iNOS的表达和活性状态可能是关键变量。 4. 为人类免疫代谢研究提供新视角：尽管人类巨噬细胞在常规培养中难以诱导iNOS，但研究在更复杂的人iPS细胞来源的骨髓类器官模型中证实了iNOS与IRG1共表达，并预测了人源蛋白相互作用的可能性，暗示该机制在人类生理病理中可能同样重要。
应用潜力： 1. 新的治疗靶点：iNOS-IRG1相互作用界面可作为设计新型抗炎或免疫调节药物的靶点。开发能特异性破坏该相互作用的小分子或肽类抑制剂，有望在不影响NO其他生理功能的前提下，选择性增强内源性衣康酸水平，从而调节炎症。 2. 精准干预策略：相较于外源性施加衣康酸衍生物（如4-辛基衣康酸），调控内源性衣康酸合成通路可能提供更生理性和更具特异性的治疗策略。
五、 研究亮点 1. 机制创新性：首次发现并证实了iNOS以不依赖NO的方式，通过直接蛋白质相互作用抑制IRG1，这是对NOS家族蛋白功能的一个重要扩展。 2. 证据链完整：从细胞表型到分子机制，研究采用了遗传学（基因敲除）、药理学、蛋白质组学、计算结构生物学、生物物理学（SPR）等多重技术手段，构成了一个严密且环环相扣的证据体系，结论非常坚实。 3. 技术方法前沿：成功运用了AlphaFold进行异源多聚体结构预测，并结合分子动力学模拟和自由能计算，为实验发现的相互作用提供了强大的理论支撑和结构模型，是计算与实验生物学结合的典范。 4. 发现关键调控节点：明确了BH4结合所决定的iNOS构象是调控该相互作用的核心，连接了辅因子代谢、蛋白质构象与免疫代谢输出，深化了对BH4在炎症中作用的理解。 5. 生理与病理意义突出：研究不仅解释了基础生物学现象，还直接指向了自身免疫性疾病、慢性炎症等过程中代谢重编程的潜在调控节点，具有明确的转化医学价值。
六、 其他有价值的内容 研究还指出，在iNOS缺失的情况下，IRG1会与一系列糖酵解酶（如PKM）、免疫因子（如IL1α）和抗氧化酶（如SOD1）等相互作用。这意味着iNOS可能通过“隔离”IRG1，间接影响IRG1与其他蛋白的互作网络，从而更广泛地调控巨噬细胞的免疫代谢状态。这为进一步研究iNOS在巨噬细胞功能塑性中的全局性调控作用开辟了新方向。