这篇研究论文《一种用于体内端粒酶逆转录酶特异性成像的新型近红外荧光探针》由长冶医学院的多位研究人员（马丹丹*、何艳斌、白慧云、李俊波、韩鹏永、杨超夫、苗聪秀）发表，于2023年10月在线发表于期刊《Microchemical Journal》2024年第196卷。这是一项关于新型生物传感器开发的原创性研究。

该研究隶属于分析化学与生物医学成像的交叉领域，具体聚焦于开发用于癌症早期诊断的新型分子影像工具。其研究背景基于一个关键的临床需求：人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）在大多数体细胞中不表达，而在高达85-90%的恶性肿瘤细胞中异常活化，使其成为极具价值的癌症诊断标志物和药物筛选靶点。然而，尽管已有多种方法（如免疫组化、RT-PCR、纳米探针等）用于检测hTERT，但它们存在操作复杂、响应慢、无法进行活细胞及体内实时成像等局限性。因此，研发一种能够快速、高灵敏度、高选择性并在活体水平对hTERT进行实时成像的小分子荧光探针，对于癌症的早期发现和疗效评估具有重要意义。本研究的主要目标正是设计并合成这样一种新型近红外荧光探针，验证其对hTERT的特异性响应机制，并最终实现在活细胞和活体肿瘤组织中对hTERT的“点亮”式荧光成像。

本研究的详细工作流程系统且严谨，可分为探针设计与合成、光谱性质与机制验证、体外检测性能评估、细胞水平成像验证以及活体水平成像应用五个主要环节。首先，研究团队设计并合成了名为NB-BIBRA的探针分子。该探针由三部分构成：1） 靶向基团，采用hTERT抑制剂BIBR1532的类似物（BIBRA），旨在特异性结合hTERT蛋白质表面的疏水口袋；2） 连接链，采用长烷基二胺链；3） 荧光报告基团，选用近红外荧光染料尼罗蓝（Nile Blue, NB）。其作用机制设计为“聚集导致淬灭”（Aggregation-Caused Quenching, ACQ）：在没有hTERT存在时，探针分子在水中倾向于形成H型聚集，导致荧光自淬灭（“关闭”状态）；而当探针与hTERT结合后，聚集态被破坏，荧光得以恢复（“点亮”状态）。探针的合成路线明确，所有中间体及最终产物的结构均通过核磁共振氢谱/碳谱（¹H NMR, ¹³C NMR）和高分辨质谱（TOF-MS）进行了充分表征。

在探针的光谱性质与响应机制研究环节，研究团队首先验证了其ACQ性质。实验显示，NB-BIBRA在有机溶剂中荧光强烈，但在PBS缓冲液中荧光极弱（量子产率Φ=0.3%），证实其形成聚集。当加入高表达hTERT的HeLa细胞裂解液后，荧光强度增强了44倍（Φ=13%）；而加入低表达hTERT的正常肝细胞L-O2裂解液或使用hTERT抑制剂BIBR1532预处理的HeLa裂解液，则无显著荧光增强。这初步证明了探针对hTERT的响应性。随后，通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）实验，观察到随着探针浓度增加，与hTERT结合的荧光条带强度增强，而用BIBR1532竞争性抑制后条带减弱，直接证实了探针与hTERT蛋白的特异性结合。此外，研究还设计了一个基于分子信标（Molecular Beacon, MB）的补充实验：在hTERT存在下，端粒酶活性被激活，延伸产物打开分子信标的发卡结构，导致荧光恢复；而用NB-BIBRA预处理细胞裂解液则会抑制此荧光恢复，进一步证明NB-BIBRA通过结合hTERT抑制了其酶活性，从而反向验证了其靶向特异性。动力学研究表明，探针对hTERT的响应非常迅速（25秒内完成），且在一定pH范围内稳定，适合活体实时成像。最后，利用分子对接软件（Sybyl 2.0和Discovery Studio 2020）进行模拟，从理论上揭示了探针BIBRA部分与hTERT拇指结构域疏水口袋内的氨基酸残基（如Arg486, Arg592）形成氢键和范德华力相互作用，从结构层面阐释了其特异性结合与荧光“点亮”的分子机制。

在体外检测性能评估环节，研究系统评价了NB-BIBRA的分析性能。首先，使用商业ELISA试剂盒定量了不同细胞系中hTERT的蛋白水平（HeLa: 10.19 pg/mL, A2780: 8.73 pg/mL, L-O2: 0.0125 pg/mL）。在此基础上，建立了探针荧光强度与hTERT浓度之间的定量关系。结果显示，在1.98至39.75 pg/mL的浓度范围内，荧光强度与hTERT浓度呈良好的线性关系，检测限低至0.11 pg/mL，表明其具有极高的灵敏度。选择性实验表明，常见的金属离子、氨基酸和其他生物分子均不会引起显著的荧光干扰，证明了探针对hTERT的高选择性。此外，测定了探针与hTERT结合的半数抑制浓度（IC50）为2.08 ± 0.12 μM，表明两者之间存在较强的结合亲和力。

在细胞水平成像验证环节，研究首先通过MTT实验证实了NB-BIBra在高达20 μM浓度下对HeLa细胞的存活率影响很小（>90%），生物相容性良好。接着，使用共聚焦荧光显微镜进行成像。结果显示，高表达hTERT的癌细胞系（HeLa和A2780）在孵育探针后呈现出强烈的红色荧光；而低表达hTERT的正常细胞系（L-O2）则几乎无荧光信号。当使用BIBR1532抑制剂预处理HeLa细胞后，荧光信号显著减弱，这再次在细胞层面证明了探针成像的特异性来源于与hTERT的相互作用。时间依赖性成像显示，探针能在10分钟内快速标记癌细胞，且荧光信号在120分钟内保持稳定，说明其具有良好的光稳定性和快速成像能力。流式细胞术分析进一步定量验证了不同细胞系荧光强度的差异。更为巧妙的是，研究团队还构建了含有短发夹RNA（shRNA）和绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒载体，将其转染入HeLa细胞。shRNA被加工成siRNA后特异性敲低hTERT的表达，结果观察到绿色荧光蛋白正常表达（转染成功指示），但探针的红色荧光信号被显著抑制。这一遗传学层面的实验，为探针信号与细胞内hTERT蛋白丰度的直接相关性提供了强有力的证据。

在活体水平成像应用环节，研究在荷瘤裸鼠模型中验证了NB-BIBRA的成像潜力。通过在皮下接种HeLa细胞形成的肿瘤内局部注射探针，利用小动物活体成像系统进行监测。结果显示，注射后5分钟即可在肿瘤区域观察到特异性的红色荧光信号，并且信号随时间增强，在60分钟时覆盖整个肿瘤区域，且未向周围正常组织扩散。为了进一步确认信号的细胞来源，研究取出了肿瘤组织制作冰冻切片进行显微观察。共聚焦荧光图像清晰地显示，红色荧光信号特异性地定位在肿瘤细胞的胞内区域，而非细胞间隙，这与hTERT作为细胞内蛋白的定位相符，确证了探针能够在活体水平上特异性成像肿瘤细胞内高表达的hTERT。

本研究的核心结论是：成功开发了一种名为NB-BIBRA的新型近红外荧光探针，该探针基于“聚集导致淬灭”与“靶向结合解聚”的“点亮”型设计，能够快速、高灵敏度、高选择性地检测并成像hTERT。探针在溶液、细胞和活体水平均表现出优异的性能，能够有效区分癌细胞与正常细胞。

这项研究具有重要的科学价值和应用潜力。其科学价值在于：1） 首次报道了一种可用于活细胞及活体内hTERT特异性成像的小分子近红外荧光探针，填补了该领域的技术空白；2） 提出并验证了一种基于蛋白质结合诱导探针聚集态解离的新型荧光“点亮”机制，为设计其他蛋白靶标的荧光探针提供了新思路。其应用价值则更为直接：NB-BIBRA作为一种高效的分子影像工具，为癌症的早期无创诊断、肿瘤边界术中界定、以及基于hTERT靶点的抗癌药物高通量筛选提供了一个强有力的平台。通过直观的荧光信号，研究人员可以在活体水平实时监测肿瘤内hTERT的活性与分布，对于理解肿瘤生物学和推进精准医疗具有重要意义。

本研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先是高度的创新性，这是首个针对hTERT的活体成像小分子近红外荧光探针；其次是巧妙的设计策略，将靶向抑制剂的类似物与荧光团结合，利用靶标结合诱导的构象变化实现荧光开关，设计精巧；第三是严谨且多层次验证体系，从溶液光谱、分子对接、凝胶电泳、细胞成像（包括抑制剂阻断和基因敲低实验）到活体成像，证据链完整，结论可信度高；第四是优异的性能参数，包括低检测限、高选择性、快速响应和良好的生物相容性；最后是成功的活体应用示范，直接证明了其在肿瘤诊断中的潜在应用价值。

此外，研究中对探针响应动力学的快速性（秒级）以及通过遗传学手段（shRNA）验证靶向特异性的实验设计，也尤为值得称道。这些内容共同构成了这项研究坚实的技术基础和深刻的内涵。