这是一项由Daniel Wendisch、Oliver Dietrich、Tommaso Mari等多位研究者共同完成的原创性研究，主要作者来自Charité – Universitätsmedizin Berlin、Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI)及Max Delbrück Center for Molecular Medicine等机构。通讯作者为Antoine-Emmanuel Saliba和Leif Erik Sander。该研究于2021年12月22日发表在Cell杂志（Cell 184, 6243–6261）上，题为“SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis”。
研究背景
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒病2019（COVID-19）在部分患者中可诱发急性呼吸窘迫综合征（ARDS），导致呼吸衰竭和高死亡率。然而，COVID-19相关ARDS的肺损伤机制尚不完全清楚。既往观点认为，严重的炎症反应或“细胞因子风暴”是导致肺损伤的主要原因，但近年来的研究发现，COVID-19重症患者体内的炎症因子水平远低于非COVID-19引起的ARDS，这提示可能存在其他重要的损伤机制。另一方面，巨噬细胞和单核细胞不仅是炎症的重要参与者，也在组织修复、重塑和纤维化中发挥关键作用。在特发性肺纤维化（IPF）中，已鉴定出具有促纤维化转录特征的巨噬细胞群体。本研究旨在探究COVID-19 ARDS中肺部免疫反应的单细胞水平特征，重点分析单核细胞来源的巨噬细胞是否获得促纤维化表型，并评估这种表型与肺纤维化的关系。
研究流程与实验方法
该研究采用了多队列、多层次的实验设计，整合了功能性单细胞基因组学、免疫组织学、电子显微镜以及体外细胞刺激实验。
首先，研究团队分析了47例重症COVID-19患者的肺组织样本和支气管肺泡灌洗液（BAL）样本。分析方法包括单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单核RNA测序（snRNA-seq）、多表位配体图谱（MELC）、免疫荧光（IF）显微镜、免疫组织化学（IHC）、RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）和透射电子显微镜（EM）。同时，结合临床评估，包括肺力学和计算机断层扫描（CT）影像。在组织学层面，对COVID-19尸检肺样本与对照样本进行了比较，检测了巨噬细胞标志物CD68和CD163的表达，并通过RNA-FISH检测了SARS-CoV-2 RNA在细胞中的定位。
随后，为了获得更高分辨率的肺部免疫反应特征，研究者对COVID-19相关ARDS患者的BAL细胞进行了scRNA-seq分析。通过无监督聚类和轨迹推断（Slingshot），区分出六种单核细胞/巨噬细胞群体：FCN1单核细胞（FCN1-mono）、过渡态单核-巨噬细胞（Mono/Mf）、CD163/LGMN巨噬细胞（CD163/LGMN-Mf）以及三种肺泡巨噬细胞（AMf1、AMf2和增殖性AMf）。研究者进一步将COVID-19相关巨噬细胞群体与已发表的IPF相关巨噬细胞转录组数据集（Adams et al., 2020; Ayaub et al., 2021; Morse et al., 2019; Reyfman et al., 2019）进行了基因集富集分析和数据整合。数据整合采用单细胞变分推断（scVI）算法，将近14万个巨噬细胞转录组映射到同一嵌入空间，并通过K近邻（KNN）邻近分析评估COVID-19巨噬细胞与IPF或健康对照巨噬细胞的相似性。
为了在组织水平验证巨噬细胞与纤维化的关系，研究者对致死性COVID-19患者肺组织进行了snRNA-seq，鉴定出15种肺细胞群体，包括巨噬细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞和周细胞。利用CellChat工具推断了巨噬细胞与间充质细胞之间的配体-受体相互作用网络，并通过免疫荧光检测了巨噬细胞（CD68）与肌成纤维细胞（SM22）以及CD163阳性巨噬细胞与胶原沉积的空间共定位关系。
临床上，研究者分析了16例需要静脉-静脉体外膜氧合（vv-ECMO）支持的重症COVID-19 ARDS患者的呼吸力学指标（如吸气肺活量VCin）、动脉血气参数和胸部CT影像的动态变化。同时对15例COVID-19 ARDS尸检样本进行了组织病理学评估，采用半定量Ashcroft评分系统评价肺纤维化程度，并通过IHC检测I型、III型和IV型胶原沉积。透射电子显微镜进一步揭示了肺泡间隔增厚、胶原纤维和弹性纤维堆积、肺泡上皮脱落及基底膜折叠等超微结构特征。
为了验证SARS-CoV-2是否可直接诱导促纤维化表型，研究者从健康供体中分离经典单核细胞（CD14+CD16–），分别用SARS-CoV-2、甲型流感病毒（IAV，H3N2亚型）、病毒RNA传感器激动剂3p-hpRNA和R848进行体外刺激。通过基于哈希标签（HTO）和单核苷酸多态性（SNP）的多重scRNA-seq分析了18小时后的转录组反应。此外，研究者还进行了多重定量鸟枪法蛋白质组学分析，在感染后1、3和18小时检测了约6951种蛋白质和5299个磷酸化位点的变化，以比较SARS-CoV-2和IAV对单核细胞蛋白质组的影响。
主要研究结果
组织学分析显示，COVID-19尸检肺组织中巨噬细胞密度显著增加，且CD163阳性巨噬细胞比例升高。SARS-CoV-2 RNA在巨噬细胞内被检测到，提示病毒可直接作用于这些细胞。MELC分析进一步证实了CD163阳性巨噬细胞的聚集，部分细胞共表达趋化因子受体CXCR3和补体因子C1Q。
在BAL单细胞转录组中，FCN1单核细胞高表达炎症因子和趋化因子，但同时也表达转化生长因子β（TGF-β）编码基因TGFB1及其下游靶基因TGFBI。CD163/LGMN巨噬细胞群体高表达骨桥蛋白SPP1、CD163和豆荚蛋白LGMN，以及多种与组织重塑和细胞外基质相关的基因。轨迹分析表明，FCN1单核细胞可沿曲线轨迹分化为CD163/LGMN巨噬细胞和肺泡巨噬细胞，提示CCL2介导的单核细胞募集和巨噬细胞分化存在前馈环路。
基因集富集分析显示，CD163/LGMN巨噬细胞群体与IPF相关巨噬细胞的转录特征高度相似。scVI数据整合和邻近分析的定量结果进一步证实，CD163/LGMN巨噬细胞和增殖性肺泡巨噬细胞与IPF相关巨噬细胞的相对邻近分数分别达到0.66和0.83，具有统计学显著性，而AMf2和FCN1单核细胞则与健康肺来源的巨噬细胞更为接近。
肺组织snRNA-seq揭示了COVID-19肺中CD163/LGMN巨噬细胞与肌成纤维细胞、成纤维细胞和周细胞之间存在强烈的细胞通讯，且这种相互作用强度在疾病后期（发病后34–82天）显著高于早期（发病后7–21天）。涉及的信号通路包括胶原（COL）、成纤维细胞生长因子（FGF）、TGFB1和SPP1等促纤维化通路。免疫荧光显示肌成纤维细胞扩增，巨噬细胞常与SM22阳性区域和胶原沉积共定位。
临床与影像分析表明，重症COVID-19 ARDS患者的吸气肺活量随时间持续下降，提示进行性限制性通气障碍。CT影像显示早期以双侧磨玻璃影和实变为特征，后期出现进行性实变和网状影，恢复期患者则有部分纤维化消退，而死亡患者则表现为持续实变和纤维条索形成。组织病理学评分显示COVID-19 ARDS的肺纤维化程度显著高于对照组，I型、III型和IV型胶原沉积明显增加。透射电镜证实了肺泡塌陷硬化和间质纤维化的超微结构特征。
体外实验显示，SARS-CoV-2刺激的健康单核细胞出现了与CD163/LGMN巨噬细胞相似的转录组特征，包括MRC1、CD163、MERTK、LGMN和MMP9等基因的特异性上调，以及TGF-β家族成员NRP1和TGFBI的诱导。基因集富集分析表明，SARS-CoV-2刺激的单核细胞显著富集了IPF相关巨噬细胞的特征基因集，而3p-hpRNA、R848或未刺激对照组则无此富集。蛋白质组学分析进一步证实，SARS-CoV-2刺激诱导了与伤口愈合和纤维化相关的蛋白质上调，包括CCL2、CCL8、CCL24、LGMN、MMP9、MMP14、TIMP1、PLA2G7、TGM2和TGFBI等。尤其值得注意的是，SARS-CoV-2诱导了CEBPB转录因子中LAP*/LAP长亚型的表达上调，而IAV则无此变化，LAP/LIP比值的增加与巨噬细胞促纤维化分化相关。
结论与意义
本研究证明，重症COVID-19相关ARDS中，单核细胞来源的巨噬细胞，尤其是CD163/LGMN巨噬细胞群体，获得了与IPF相关巨噬细胞高度相似的促纤维化转录和蛋白表达谱。SARS-CoV-2本身足以在体外诱导人单核细胞出现这种促纤维化表型，而甲型流感病毒不能。同时，临床、影像、组织学和超微结构证据均表明，COVID-19 ARDS伴随显著的纤维增殖性重塑。这些结果提示SARS-CoV-2可直接触发巨噬细胞的促纤维化重编程，进而推动肺纤维化进程。这一发现为理解COVID-19的长期肺后遗症提供了新的病理机制解释，并为开发针对巨噬细胞促纤维化通路的治疗策略提供了潜在靶点。
研究亮点
本研究的突出之处在于：（1）首次系统性揭示了COVID-19 ARDS中巨噬细胞获得与IPF高度相似的促纤维化特征；（2）利用单细胞多组学、多队列整合与邻近分析相结合的策略，定量评估了巨噬细胞转录组与IPF的相似性；（3）通过体外病毒刺激实验，区分了SARS-CoV-2与IAV在促纤维化巨噬细胞程序诱导中的差异；（4）将转录组、蛋白质组与临床、影像、组织学和超微结构证据整合，形成了多层次的因果推断链条。这些创新为病毒诱导器官纤维化的研究提供了范式。