学术报告：中性粒细胞外泌体 miR-30d-5p 在脓毒症相关急性肺损伤中诱导 M1 巨噬细胞极化并启动巨噬细胞焦亡

一、研究作者、机构与发表信息

本研究由 Yang Jiao、Ti Zhang、Chengmi Zhang 等学者合作完成，通讯作者为 Zhengliang Ma（南京大学医学院附属鼓楼医院麻醉科）与 Xueyin Shi（上海交通大学医学院附属新华医院麻醉与重症医学科）。该研究发表于 Critical Care 期刊，文章于 2021 年 9 月在线发表，DOI 编号为 10.1186/s13054-021-03775-3。

二、研究背景与目的

脓毒症（sepsis）已被世界卫生组织（WHO）列为全球健康优先事项，其住院患者死亡率高达 30%–45%。急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是脓毒症最常见且最严重的器官功能障碍表现之一，而脓毒症相关急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是导致患者死亡的重要因素。多形核中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils，PMNs）在脓毒症相关 ALI 的发病机制中发挥关键作用。外泌体（exosomes）是一种直径约 30–150 nm 的细胞外囊泡，能够将蛋白质、mRNA、microRNA（miRNA）等多种生物分子传递至靶细胞，介导细胞间通讯。已有动物研究表明，PMN 来源的外泌体在慢性阻塞性肺疾病（COPD）、支气管肺发育不良和哮喘等慢性肺损伤中发挥作用，但其在脓毒症相关 ALI 中的功能尚不清楚。

肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是脓毒症相关 ALI 中固有免疫的关键调控因子。巨噬细胞（macrophage，Mφ）的 M1 极化和焦亡（pyroptosis）在脓毒症相关 ALI 的炎症放大中具有重要作用。焦亡是一种依赖于半胱天冬酶-1（caspase-1）的促炎性细胞死亡形式，NOD 样受体 3（NLRP3）炎症小体的激活可剪切 gasdermin D（GSDMD），导致细胞膜穿孔和 IL-1β、IL-18 的释放。中性粒细胞与巨噬细胞之间的相互作用已被广泛报道，但 PMN 来源外泌体对巨噬细胞行为的影响及其在脓毒症相关 ALI 中的机制尚不明确。因此，本研究旨在探究 PMN 来源外泌体在脓毒症相关 ALI 中的作用及其分子机制。

三、研究的详细工作流程

本研究采用体内与体外实验相结合的策略，主要包含以下几个实验步骤：

1. PMN 的分离与激活。 研究者从健康 C57BL/6J 小鼠腹腔中通过酪蛋白诱导募集 PMNs，采用 Histopaque-1077 和 Histopaque-1119 不连续密度梯度离心法分离 PMNs，经流式细胞术和台盼蓝染色鉴定其纯度约为 90%、活力约为 95%。分离后的 PMNs 在无外泌体胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中培养，以 20 ng/ml 的 TNF-α 刺激 12 小时诱导活化，同时以等体积 PBS 处理作为阴性对照。

2. 外泌体的分离与鉴定。 使用 Total Exosome Isolation 试剂从 PMN 培养上清中分离外泌体，分别获得 PBS 处理组来源外泌体（pbs-exo）和 TNF-α 刺激组来源外泌体（tnf-exo）。通过透射电子显微镜（TEM）观察到外泌体呈杯状形态，直径约 70 nm；Western blot 检测发现外泌体标志物 CD9、CD63 和 TSG101 高表达，证实外泌体分离成功。

3. 体内外泌体功能实验。 将 pbs-exo 或 tnf-exo（300 μg/只）通过腹腔注射至 C57BL/6J 野生型小鼠体内，24 小时后收集腹腔灌洗液检测腹腔巨噬细胞表型，同时取肺组织进行 H&E 染色和免疫荧光染色评估肺损伤及巨噬细胞极化情况。为了探究 miR-30d-5p 的体内功能，研究者通过尾静脉注射 miR-30d-5p 抑制剂（50 μg/只）于外泌体注射前 1 天进行体内转染。

4. 体外共培养实验。 将 RAW264.7 巨噬细胞系或骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）与 PMN 来源外泌体（100 μg/ml）共培养 24 小时。为诱导焦亡，巨噬细胞先用外泌体预处理 24 小时，再加入 5 mM ATP 或 20 μM nigericin 刺激 2 小时。为验证 miR-30d-5p 的功能，RAW264.7 巨噬细胞在共培养前 24 小时转染 miR-30d-5p 抑制剂或模拟物。

5. 外泌体 miRNA 测序与数据分析。 从 pbs-exo 和 tnf-exo 中提取总 RNA，利用 BGISEQ-500 平台进行 miRNA 测序。采用 t 检验计算差异表达 miRNA，以表达量变化≥2 倍且 p 值<0.05 为显著差异标准。通过 KEGG 通路富集分析筛选与信号转导相关的通路。

6. 定量实时 PCR（RT-qPCR）。 提取外泌体、细胞或肺组织中的总 RNA，检测 miR-30d-5p、炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）、iNOS、NLRP3、caspase-1 以及 SOCS-1 和 SIRT1 的表达水平。

7. 荧光素酶报告基因实验。 将含有 miR-30d-5p 预测结合位点的 SOCS-1/SIRT1 3′-UTR 序列及其突变体克隆入质粒载体，转染 HEK293 细胞，检测荧光素酶活性以验证 miR-30d-5p 与靶基因的直接结合。

8. 盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）脓毒症模型。 小鼠麻醉后行腹正中切口，将盲肠结扎并用 18G 针头穿刺以诱导脓毒症。miR-30d-5p 抑制剂在手术前 1 天通过尾静脉注射进行体内转染。24 小时后处死小鼠，收集肺组织进行组织学和分子检测，并观察生存率。

四、主要研究结果

1. tnf-exo 在体内诱导肺损伤并促进 M1 巨噬细胞活化和焦亡。 荧光成像显示，tnf-exo 腹腔注射后可在肺组织中富集。H&E 染色显示 tnf-exo 组小鼠肺组织出现明显的组织学损伤。RT-qPCR 检测发现 tnf-exo 组肺组织中 iNOS、IL-1β 和 TNF-α 的表达显著升高。免疫荧光染色显示 tnf-exo 组肺内 iNOS+/F4/80+ M1 巨噬细胞数明显增多。流式细胞术检测发现 tnf-exo 组腹腔巨噬细胞中 CD11c+CD206− M1 表型比例显著增加，Annexin V+PI+ 死亡细胞比例升高，caspase-1/TUNEL 双阳性焦亡细胞约占 8%。以上结果表明 tnf-exo 可通过促进 M1 巨噬细胞活化和焦亡诱导肺部炎症。

2. tnf-exo 通过 NF-κB 通路促进 M1 巨噬细胞活化并启动焦亡。 体外共培养实验结果显示，tnf-exo 可显著上调 RAW264.7 巨噬细胞 CD11c 表达和促炎因子（iNOS、IL-1β、TNF-α）mRNA 水平，同时下调 M2 标志物（MRC1、Arg1、Fizz1、Ym1）表达。有趣的是，tnf-exo 单独处理并不能直接诱导巨噬细胞焦亡，但在加入 ATP 或 nigericin 后，tnf-exo 预处理组巨噬细胞的焦亡率和 GSDMD 切割显著增加，IL-1β 分泌增多。RT-qPCR 显示 tnf-exo 可上调 NLRP3 和 caspase-1 的 mRNA 表达。蛋白质组学富集通路分析提示 NF-κB 信号通路在其中发挥关键作用，Western blot 证实 tnf-exo 可增加 NF-κB p65 磷酸化水平。上述结果表明 tnf-exo 作为“启动信号”通过激活 NF-κB 通路上调 NLRP3 炎症小体表达，而 ATP/nigericin 作为“第二信号”触发焦亡的执行。

3. miR-30d-5p 是 tnf-exo 中的功能分子。 miRNA 测序发现 26 种 miRNA 在 tnf-exo 中表达上调≥2 倍。KEGG 富集分析显示 NF-κB 信号通路位于前 20 个最富集通路之中。通过文献检索，研究者聚焦于 miR-30d-5p。RT-qPCR 验证了 tnf-exo 中 miR-30d-5p 表达显著高于 pbs-exo；同时发现 TNF-α 刺激后 PMNs 细胞内 miR-30d-5p 水平反而下降，提示 miR-30d-5p 从细胞内转移至外泌体中。巨噬细胞与 tnf-exo 共培养后，细胞内 miR-30d-5p 水平显著升高，表明外泌体可将 miR-30d-5p 传递给巨噬细胞。

4. miR-30d-5p 通过靶向 SOCS-1 和 SIRT1 激活 NF-κB。 在巨噬细胞中转染 miR-30d-5p 抑制剂可逆转 tnf-exo 诱导的 M1 极化、促炎因子上调和 NF-κB p-p65 蛋白表达，同时下调 NLRP3 和 caspase-1 mRNA 水平，抑制 caspase-1 活化和 GSDMD 切割。生物信息学预测显示 SOCS-1 和 SIRT1 是 miR-30d-5p 的潜在靶基因，二者均为 NF-κB 信号通路的负调控因子。双荧光素酶报告基因实验证实 miR-30d-5p 可直接结合 SOCS-1 和 SIRT1 的 3′-UTR。过表达 miR-30d-5p 可抑制 SOCS-1 和 SIRT1 的 mRNA 和蛋白表达。tnf-exo 处理可降低 SOCS-1 和 SIRT1 表达，同时增加 NF-κB p65 第 310 位赖氨酸的乙酰化水平，而 miR-30d-5p 抑制剂可逆转这一效应。这些结果表明外泌体 miR-30d-5p 通过靶向 SOCS-1 和 SIRT1 导致 NF-κB 通路激活，进而促进 M1 极化和焦亡启动。

5. miR-30d-5p 抑制可改善 tnf-exo 和 CLP 诱导的肺损伤。 tnf-exo 腹腔注射后肺组织中 miR-30d-5p 表达显著升高。尾静脉预先注射 miR-30d-5p 抑制剂可显著降低 tnf-exo 诱导的 IL-1β、iNOS、NLRP3、caspase-1 表达，减少肺内 M1 巨噬细胞活化和巨噬细胞死亡，并改善肺组织学损伤。在 CLP 脓毒症模型中，肺组织 miR-30d-5p 同样显著上调。miR-30d-5p 抑制剂可降低 CLP 小鼠肺组织中 IL-6、iNOS、NLRP3 的表达，减少 M1 巨噬细胞活化和肺内细胞死亡，改善肺损伤评分，并显著提高 CLP 小鼠的生存率。

五、研究结论与意义

本研究首次证明 PMN 来源的外泌体 miR-30d-5p 在脓毒症相关 ALI 中通过靶向 SOCS-1 和 SIRT1 激活 NF-κB 信号通路，诱导 M1 巨噬细胞极化并启动巨噬细胞焦亡。这一发现揭示了一种此前未被认识的中性粒细胞-巨噬细胞相互作用的新机制：活化的中性粒细胞通过外泌体将 miR-30d-5p 传递给巨噬细胞，促进其向促炎表型转化并增强其对焦亡信号的敏感性，从而放大肺部炎症反应，促进肺损伤的发生发展。在科学价值上，该研究阐明了脓毒症相关 ALI 中 PMN-巨噬细胞通讯的分子细节，拓展了外泌体 miRNA 在固有免疫调控中的功能认识。在应用价值上，miR-30d-5p 有望成为脓毒症相关 ALI 的新的分子治疗靶点，靶向抑制 miR-30d-5p 可能为脓毒症相关 ARDS 的治疗提供新的策略。

六、研究亮点

本研究的亮点体现在以下几个方面：首先，在科学发现上，首次揭示了 PMN 来源外泌体 miR-30d-5p 通过 SOCS-1/SIRT1/NF-κB 轴调控巨噬细胞极化和焦亡的全新机制。其次，在研究策略上，将体外共培养体系与体内 CLP 脓毒症模型有机结合，从外泌体 miRNA 测序到靶基因验证再到功能回复实验，形成了完整的证据链。再次，在技术手段上，运用了 miRNA 测序、蛋白质组学、双荧光素酶报告基因以及体内 miRNA 抑制剂的肺部转染等多种方法，多维度验证了假设。此外，研究还发现 tnf-exo 在体外仅作为“启动信号”而非直接诱导焦亡，这一结果阐明了外泌体在体内促进焦亡的间接机制，为理解炎症微环境中细胞死亡信号的协同调控提供了重要视角。