一项关于脂肪间充质干细胞外泌体通过SIRT1/NRF2信号轴抑制巨噬细胞铁死亡以减轻脓毒症急性肺损伤的研究报告
主要作者及发表信息
该研究由第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科的白晓智、刘洋、刘佳琪、郭凯及管昊等人完成，其中白晓智与刘洋为共同第一作者，管昊为通讯作者。论文发表于 International Immunopharmacology 第146卷（2025年），于2024年12月27日在线发表，DOI为10.1016/j.intimp.2024.113914。
研究背景
脓毒症（sepsis）是一种由宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，在重症监护病房中极为常见，其院内病死率在亚洲约为22.4%，90天病死率高达36.6%。脓毒症最常见的致死原因为多器官功能障碍综合征（MODS），其中急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是最早期且最严重的并发症之一，也是导致患者短期死亡及长期生活质量下降的重要原因。巨噬细胞和肺微血管内皮细胞是急性肺损伤的主要参与者。在脓毒症过程中，肺组织内常驻巨噬细胞被激活并向促炎的M1表型极化，分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）和白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子；过量炎症因子与活性氧（ROS）攻击肺微血管内皮细胞，引发级联放大效应，最终造成不可逆的器官功能损伤。
铁死亡（ferroptosis）是一种不同于凋亡、自噬及其他细胞死亡形式的调节性细胞死亡方式，其核心特征为细胞内铁代谢异常和脂质过氧化。近年来越来越多的证据表明铁死亡在脓毒症所致多器官功能障碍的发病机制中发挥关键作用。脂肪间充质干细胞来源外泌体（ADSC-exo）已被广泛报道可改善组织修复与再生，并具有抗炎特性。既往研究及该课题组的前期工作表明，ADSC-exo可通过抑制过度炎症反应改善盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的脓毒症小鼠器官损伤，且SIRT1是其中的关键调节因子。SIRT1可通过调节核因子E2相关因子2（NRF2）信号通路调控巨噬细胞的氧化应激反应。然而，ADSC-exo是否通过上调SIRT1激活NRF2通路进而抑制巨噬细胞铁死亡，其具体机制尚未阐明。本研究旨在验证ADSC-exo是否可通过激活SIRT1/NRF2信号轴抑制巨噬细胞铁死亡，从而减轻脓毒症所致急性肺损伤。
研究流程与方法
该研究综合采用了体外细胞实验与体内动物模型实验，主要分为以下几个步骤：
1. 人脂肪间充质干细胞的分离、培养与鉴定。 从西京医院接受吸脂手术的年轻女性获取正常皮下脂肪组织，采用I型胶原酶消化法分离ADSCs，使用人ADSC专用培养基培养，取第3至5代细胞用于实验。通过流式细胞术检测CD31、CD34、CD90和CD105的表达以鉴定细胞纯度；通过成脂诱导（油红O染色）和成骨诱导（茜素红染色）验证其多向分化能力。
2. ADSC-exo的分离与鉴定。 取第3至5代ADSCs，当细胞融合度达80%时，将常规培养基更换为含10%无外泌体血清的DMEM-F12培养基，继续培养24小时后收集上清，采用差速超速离心法分离外泌体。通过透射电子显微镜（TEM）观察外泌体形态（典型杯状结构），纳米颗粒追踪分析（NTA）显示粒径主要分布在80-150 nm，Western blot检测外泌体标志蛋白CD9和CD63为阳性。外泌体蛋白浓度为2 μg/μl，并采用PKH26标记验证其可被RAW264.7巨噬细胞摄取。
3. 体外细胞实验。 使用RAW264.7小鼠巨噬细胞系，分为对照组、LPS组（1 μg/ml LPS处理4小时）和LPS+ADSC-exo组（1.25×10⁹ particles/ml）。通过RT-PCR检测TNF-α和IL-1β的mRNA水平；Western blot检测iNOS、Arg-1、GPX4、4-HNE、HO-1、NRF2（细胞核蛋白）、SIRT1等蛋白表达；通过DCFH-DA荧光染色检测ROS水平；JC-1染色检测线粒体膜电位；检测超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性。此外，使用SIRT1 siRNA转染RAW264.7细胞以敲低SIRT1表达，观察其对ADSC-exo保护效应的影响。
4. 体内脓毒症小鼠模型。 采用健康清洁级成年雄性C57小鼠（20-25g）及髓系特异性SIRT1敲除（SIRT1⁻/⁻）小鼠，通过盲肠结扎穿孔（CLP）手术建立脓毒症模型。ADSC-exo（200 μg/100 μl/只）或等体积PBS于手术前一天及手术当天经尾静脉注射。术后24小时处死小鼠，收集肺组织和血液。左肺用于湿/干比（W/D）测定评估肺水肿；右肺用于支气管肺泡灌洗液（BALF）蛋白含量测定，并分为两部分分别用于组织病理学检查和-80°C冻存。通过H&E染色评估肺组织病理损伤；免疫组化检测4-HNE表达；免疫荧光检测iNOS和CD68表达；ELISA检测血清TNF-α和IL-1β水平；试剂盒检测肺组织MDA、GSH、SOD水平。在部分实验中，给予铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）处理，以验证铁死亡在SIRT1敲除所致损伤中的作用。
5. 数据分析。 所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。两组间比较采用Student’s t检验，多组间比较采用方差分析（ANOVA），P<0.05认为差异有统计学意义。
主要研究结果
ADSCs与ADSC-exo的鉴定： 流式细胞术显示分离的ADSCs高表达间充质干细胞标志物CD90和CD105，而内皮/造血标志物CD31和CD34阴性；成脂和成骨诱导染色证实其多向分化能力。TEM显示外泌体呈典型杯状形态，NTA证实粒径主要分布于80-150 nm，Western blot检测到CD63和CD9阳性，证明外泌体分离成功。
ADSC-exo抑制巨噬细胞M1极化并减轻炎症： LPS刺激后RAW264.7细胞TNF-α和IL-1β mRNA水平显著升高，而ADSC-exo处理后这两种炎症因子水平下降至约原来的三分之一。Western blot显示LPS诱导后M1型标志物iNOS显著上调，而ADSC-exo处理使M2型标志物Arg-1水平显著升高，几乎恢复至LPS处理前水平，表明ADSC-exo可逆转巨噬细胞向M1表型的极化并缓解炎症反应。
ADSC-exo缓解LPS诱导的氧化应激： LPS诱导后巨噬细胞内ROS含量显著增加，ADSC-exo处理则明显降低ROS水平。JC-1染色显示LPS组线粒体膜电位异常降低（JC-1聚集体减少、单体增多），ADSC-exo干预后线粒体膜电位恢复至接近正常水平。Western blot显示ADSC-exo可上调GPX4表达并降低4-HNE水平，提示脂质过氧化减轻。同时，LPS组SOD水平降低、CAT活性升高，而ADSC-exo处理使SOD和CAT活性均显著增高，表明抗氧化能力增强。
ADSC-exo减轻脓毒症小鼠肺损伤： H&E染色显示CLP组肺泡内大量炎症细胞浸润、渗出物致肺泡塌陷，ADSC-exo治疗组渗出和炎症细胞浸润明显减少。肺湿/干比在CLP组明显升高，ADSC-exo处理后降低近三分之一；BALF蛋白含量亦呈相似趋势。肺组织TNF-α和IL-1β表达水平在脓毒症小鼠中升高5-6倍，ADSC-exo将其降低约一半。免疫荧光显示CLP术后iNOS表达显著增加，ADSC-exo可部分降低其表达。
ADSC-exo改善肺组织氧化应激水平： 免疫组化显示脓毒症小鼠肺组织中4-HNE表达显著升高，ADSC-exo处理显著降低其水平。脓毒症后血清MDA和ROS水平升高，GSH和SOD水平耗竭；ADSC-exo可显著降低MDA和ROS并恢复SOD和GSH水平，增强抗氧化能力。
ADSC-exo通过SIRT1调节巨噬细胞铁死亡： LPS诱导的巨噬细胞中SIRT1和HO-1水平降低，NRF2核转位减少；ADSC-exo处理可逆转上述变化。SIRT1 siRNA干扰后，LPS诱导的巨噬细胞ROS水平进一步升高，ADSC-exo无法上调NRF2/HO-1通路，HO-1和GPX4表达降低，线粒体膜电位进一步下降，铁死亡加重。这表明ADSC-exo抑制巨噬细胞铁死亡依赖于SIRT1的调控作用。
SIRT1敲除削弱ADSC-exo保护作用而铁死亡抑制剂可逆转损伤： 在野生型脓毒症小鼠中，ADSC-exo治疗可减轻肺组织损伤并降低4-HNE水平；但在髓系特异性SIRT1⁻/⁻小鼠中，即使给予ADSC-exo，肺组织损伤仍较野生型加重，4-HNE和炎症因子水平显著升高。而给予铁死亡抑制剂Fer-1后，肺组织损伤、4-HNE水平和炎症因子水平均降低，表明SIRT1敲除所致的组织损伤通过铁死亡通路介导，抑制铁死亡可显著缓解损伤。
ADSC-exo通过SIRT1/NRF2轴抑制铁死亡改善氧化应激： 在野生型小鼠中，ADSC-exo处理后无论是否给予Fer-1，GSH和SOD水平无显著差异，但Fer-1可轻微降低MDA水平，提示ADSC-exo改善脂质过氧化并非仅依赖铁死亡抑制。在SIRT1⁻/⁻小鼠中，ADSC-exo无法缓解脓毒症诱导的氧化应激，表现为NRF2核转位减少、HO-1水平降低、ROS和MDA升高、GSH和SOD降低；而抑制铁死亡则显著改善小鼠的氧化应激状态。
结论与意义
该研究证实，ADSC-exo可通过上调巨噬细胞内SIRT1的表达，促进NRF2核转位并激活下游抗氧化通路NRF2/HO-1/GPX4，从而抑制LPS诱导的巨噬细胞铁死亡，减轻氧化应激损伤和炎症反应，最终缓解脓毒症所致急性肺损伤。在髓系特异性SIRT1敲除小鼠中，ADSC-exo的保护作用被显著削弱，而铁死亡抑制剂Fer-1可逆转这一不良效应，进一步验证了SIRT1/NRF2/铁死亡轴在该保护机制中的核心作用。该研究揭示了ADSC-exo治疗脓毒症急性肺损伤的一种新的潜在机制，即ADSC-exo并非通过直接递送SIRT1蛋白，而是通过上调巨噬细胞内源性SIRT1水平发挥作用。这一发现为脓毒症急性肺损伤的治疗提供了重要的理论依据和潜在干预靶点。
研究亮点
本研究的亮点在于：第一，首次系统阐明了ADSC-exo通过SIRT1/NRF2信号轴抑制巨噬细胞铁死亡从而减轻脓毒症急性肺损伤的分子机制；第二，采用髓系特异性SIRT1敲除小鼠结合铁死亡抑制剂Fer-1的干预策略，从正反两方面验证了SIRT1/铁死亡通路的关键作用；第三，发现ADSC-exo的作用方式为上调巨噬细胞内源性SIRT1而非外源性递送，为理解干细胞外泌体的免疫调节机制提供了新视角。
研究局限性
该研究亦存在一定局限性。作者指出，ADSC-exo在脓毒症中的抗炎和抗氧化效应可能还涉及其他通路，且ADSC-exo促进SIRT1/NRF2通路激活的具体分子机制仍需进一步研究。