学术研究报告：基于实时荧光定量PCR（real-time PCR）的食品中大肠杆菌O157检测方法

一、研究作者与发表信息
本研究由Benjamin Junge、Cordt Grönewald和Kornelia Berghof-Jäger（来自德国Biotecon Diagnostics GmbH公司）共同完成，发表于《Journal of AOAC International》2011年第94卷第6期。研究获得了AOAC研究所的独立认证（Performance Tested MethodSM认证），DOI编号为10.5740/jaoacint.11-097。

二、学术背景与研究目标
科学领域：本研究属于食品安全与微生物检测领域，聚焦于食源性致病菌——大肠杆菌O157（Escherichia coli O157）的快速检测技术。
研究背景：大肠杆菌O157（尤其是O157:H7血清型）可产生强效毒素，引发血性腹泻甚至肾衰竭，美国每年约7.3万例感染病例。传统培养法耗时较长（需数天），而实时荧光定量PCR（real-time PCR）技术通过特异性引物和水解探针（hydrolysis probes，即TaqMan探针）可大幅缩短检测时间，并实现实时监测扩增过程。
研究目标：验证一种结合DNA快速提取（FoodProof® ShortPrep II Kit）和实时PCR检测（FoodProof E. coli O157 Detection Kit）的方法，评估其在复杂食品基质中的准确性、重复性和特异性。

三、研究流程与方法
1. 样本选择与预处理
- 食品基质：选取AOAC推荐的3类代表性食品（鸡蛋沙拉、大块法兰克福香肠、苹果汁），每类食品分为低接种量（1–10 CFU/25 g）、高接种量（10–50 CFU/25 g）和未接种对照组（各5份），总计135份样本。
- 菌株来源：使用Biotecon Diagnostics提供的3株大肠杆菌O157（表1），包括O157:H7和O157:H-血清型。

1. DNA提取与纯化

   • 试剂盒：采用FoodProof ShortPrep II Kit，通过机械破碎（8分钟）和高温裂解（95–100°C，10分钟）快速提取DNA，离心后获得上清液用于PCR。
     
   • 关键步骤：避免交叉污染，使用尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）降解残留DNA。
     

2. 实时PCR检测

   • 试剂与仪器：
     
     • 检测试剂盒：FoodProof E. coli O157 Detection Kit包含预混引物、水解探针（FAM/VIC标记）和内部对照（防止假阴性）。
       
     • 仪器：Roche LightCycler® 480和Agilent MX3005P两种实时PCR仪，均支持96孔板高通量检测，40分钟内完成扩增。
       
   • 反应体系：25 µL标准反应体积，包含5 µL模板DNA，预扩增（37°C 4分钟，95°C 5分钟）后进行50循环扩增（95°C 5秒，60°C 60秒）。
     

3. 结果判读

   • 双通道分析：FAM通道检测大肠杆菌O157靶基因，VIC/HEX通道检测内部对照。根据荧光信号判定结果（表3），如双阳性为有效检测。
     

4. 方法学验证

   • 重复性研究：比较PCR法与FDA-BAM/USDA-FSIS传统培养法的结果一致性。
     
   • 包容性与排他性测试：
     
     • 包容性（inclusivity）：60株不同来源的大肠杆菌O157（含38株O157:H7）均被检出，无假阴性（表7-8）。
       
     • 排他性（exclusivity）：30株非目标菌（如其他血清型大肠杆菌、沙门氏菌等）均未产生交叉反应（表9）。
       

四、主要研究结果
1. 重复性研究
- 灵敏度与特异性：
- 低接种量：灵敏度95%（18/19），特异性100%（42/41），假阴性率5%（1/20）。
- 高接种量：灵敏度103%（40/39），特异性95%（20/21），假阳性率4.5%（1/22）。
- 统计学等效性：卡方检验（χ²）显示PCR法与参考方法无显著差异（χ² <3.84，表5-6）。

1. 检测限与一致性

   • 所有未接种样本均为阴性，证实无假阳性。
     
   • 不同食品基质中，PCR与培养法结果高度一致（表4），例如鸡蛋沙拉低接种量组PCR检出5份，培养法检出6份。
     

2. 仪器兼容性

   • LightCycler 480与MX3005P的检测结果完全一致，表明方法适用于不同平台。
     

五、研究结论与价值
1. 科学价值：
- 首次通过AOAC认证的实时PCR方法，结合快速DNA提取技术，将检测时间从传统方法的数天缩短至数小时。
- 通过双通道设计和内部对照，显著降低假阴性/假阳性风险。

1. 应用价值：
   
   • 适用于复杂食品基质（如高脂肪香肠、酸性果汁），为食品安全监管提供高效工具。
     
   • 方法兼容主流实时PCR仪，便于实验室推广。
     

六、研究亮点
1. 技术创新：
- 采用5′核酸酶（TaqMan）探针技术，实现实时监测与高特异性。
- ShortPrep II Kit的机械-热裂解法优化了食品中DNA提取效率。

1. 严谨验证：
   
   • 覆盖60株目标菌和30株非目标菌，数据支撑性强。
     
   • 通过FDA与USDA标准双重验证，结果具权威性。
     

七、其他价值
- 研究引用的菌株库（如ATCC 43895、NCTC 12079）为后续研究提供参考。
- 提出的χ²等效性检验模型可用于其他微生物检测方法的评估。