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单细胞数字微流控质谱平台用于循环肿瘤细胞高效多重基因分型
第一作者及研究机构
该研究由Qingyu Ruan（第一作者）、Jian Yang、Fenxiang Zou等共同完成，通讯作者为Lingling Wu、Shuichao Lin和Chaoyong Yang。研究团队来自厦门大学化学化工学院（State Key Laboratory of Physical Chemistry of Solid Surfaces, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University）和上海交通大学医学院附属仁济医院（Institute of Molecular Medicine, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University）。研究成果发表于《Analytical Chemistry》期刊，2022年1月出版（Volume 94, Issue 3, Pages 1108–1117）。
学术背景
研究领域与科学问题
该研究属于液体活检（liquid biopsy）和单细胞分析（single-cell analysis）领域，聚焦于循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）的基因突变分析。CTCs是从原发或转移肿瘤脱落到血液中的细胞，能够反映肿瘤的分子特征，但其在血液中极其稀有（每毫升血液中仅含数个CTCs），且具有高度异质性。传统的组织活检（tissue biopsy）存在侵入性、采样局限性等问题，而现有的单细胞CTCs基因分型技术（如qPCR和测序）存在通量低、成本高或检测效率不足等缺陷。
研究目标
开发一种集成化平台DMF-scMS（Digital Microfluidics-single-cell Mass Spectrometry），结合数字微流控（DMF）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS），实现单细胞CTCs的高效、多重基因突变分析，为精准医疗提供实时分子信息。
研究流程与方法
1. 数字微流控芯片设计与单细胞捕获
- 芯片结构：DMF芯片包含95个电极阵列和10个亲水点（hydrophilic spots），通过电润湿（electrowetting-on-dielectric, EWOD）技术操控纳升级液滴，完成单细胞分离、裂解和全基因组扩增（Whole Genome Amplification, WGA）。
- 单细胞捕获策略：
- 亲水点捕获：利用亲水点与周围疏水区域的表面能差异，被动分配含单细胞的亚液滴。
- 流体动力学调控：通过液滴滚动产生混沌流（chaotic flow），调整细胞分布，选择性分离目标CTCs（如从白细胞中分离）。
- 捕获效率优化：在细胞浓度≤1×10³ cells/mL时，单细胞捕获效率达100%。
2. 单细胞全基因组扩增（WGA）
- 裂解与扩增：在亲水点内完成细胞裂解（碱性裂解缓冲液）和多重置换扩增（Multiple Displacement Amplification, MDA），反应体积仅12.2 nL，减少扩增偏差和污染。
- 产物回收：通过低吸附移液器回收扩增产物，经磁珠纯化后用于下游分析。
3. 多重基因扩增与质谱检测
- 靶基因扩增：使用模块化引物面板（modular primer panels）扩增KRAS和EGFR基因的6个突变位点（如KRAS G12/G13、EGFR L858R/T790M）。
- 单碱基延伸（Primer Extension）：在突变位点延伸单个双脱氧核苷酸（ddNTP），利用MALDI-TOF MS检测延伸产物的质荷比（m/z）差异。
- 质谱参数：激光波长355 nm，电压20 kV，延迟提取时间400 ns，检测灵敏度达50 nM。
4. 临床样本验证
- 样本来源：5例结直肠癌患者血液样本（经Dynarface-chip预富集CTCs）。
- 检测流程：免疫荧光鉴定CTCs（CK+/CD45−/DAPI+），通过DMF-scMS分析KRAS突变。
- 结果一致性：CTCs的突变谱与组织活检结果完全匹配（如KRAS G12C/G12V/G13D）。
主要研究结果
单细胞捕获与扩增效率
- 亲水点直径200 μm时，单细胞捕获效率达97.8%。
- WGA产物质量高（Qubit检测浓度>30 ng/μL），支持多重基因分析。
质谱检测的准确性与多重性
- MALDI-TOF MS可区分单核苷酸多态性（SNPs），如KRAS G12D（m/z 8181.5）与野生型（m/z 8172.5）的差异仅9 Da。
- 六重突变检测（KRAS/EGFR）的变异系数（CV）<0.06‰，显示高重复性。
临床样本分析
- 在患者CTCs中检出KRAS G12V/G13D等突变，与组织活检一致。
- 同一患者的CTCs呈现突变异质性（如CTC A无突变，CTC B携带KRAS G12D），凸显单细胞分析的价值。
研究结论与意义
科学价值
- 首次将DMF与MALDI-TOF MS结合，实现单细胞CTCs的高通量、多重基因分型，解决了现有技术（如测序）的成本和效率瓶颈。
- 揭示了CTCs的突变异质性，为肿瘤进化研究提供新工具。
应用价值
- 可作为液体活检的补充手段，动态监测肿瘤突变谱，指导靶向治疗（如EGFR抑制剂选择）。
- 平台耗时约20小时，未来可通过集成化进一步缩短流程。
研究亮点
技术创新
- 亲水点捕获与混沌流调控：实现复杂样本（如血液）中稀有CTCs的高效选择性分离。
- 纳升级反应体系：减少扩增偏差，提高灵敏度。
方法学优势
- 无需探针标记或测序，直接通过质谱检测天然碱基质量差异，成本低且通量高。
- 可扩展至其他已知突变位点的检测（需设计特异性引物）。
其他有价值内容
- 局限性：目前仅适用于已知突变检测，未知突变需结合测序（如作者提到的digital-WGS）。
- 未来方向：开发更高通量的电极阵列，或整合EWOD-MALDI实现芯片内直接质谱检测。
（注：术语翻译示例：数字微流控-Digital Microfluidics (DMF)；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱-Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS)）