一项关于MTHFD2如何通过上调PD-L1促进肿瘤免疫逃逸的原创性研究

第一，研究作者与发表信息 本研究的核心作者包括 Shang, Man、 Yang, Huijie、 Yang, Ran、 Chen, Tao、 Fu, Yuan、 Li, Yeyi、 Fang, Xianlong、 Zhang, Kangjian、 Zhang, Jianju、 Li, Hui、 Cao, Xueping、 Gu, Jinfa、 Xiao, Jianwen、 Zhang, Qi、 Liu, Xinyuan、 Yu, Qiujing 与 Wang, Ting。通讯作者为 Qiujing Yu 和 Ting Wang。主要研究机构来自天津医科大学基础医学院药理学系、天津炎症生物学重点实验室、省部共建医学表观遗传协同创新中心，以及上海东方医院、上海元淦生物科技有限公司、中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞生物学国家重点实验室等多家单位。该研究于2021年发表在 Nature Communications 期刊上，文章标题为”The folate cycle enzyme MTHFD2 induces cancer immune evasion through PD-L1 up-regulation”。

第二，学术背景与研究目的 本研究属于肿瘤代谢与肿瘤免疫学交叉领域。近年来，代谢重编程被认为是肿瘤和免疫细胞的共同特征。越来越多的证据表明，代谢物和代谢酶除了为细胞提供生物能量和生物合成原料外，还能通过直接相互作用或调节蛋白质翻译后修饰等方式，发挥非代谢功能，调控细胞信号转导和免疫细胞的攻击能力。然而，肿瘤自身为了满足其生长和增殖需求而重编程的代谢通路，是否以及如何能够直接刺激肿瘤细胞内的信号，使其获得抵抗免疫攻击的能力，这一机制尚不明确。

本研究的核心目标是探索肿瘤代谢重塑如何直接导致其免疫抵抗。研究者特别关注了叶酸循环（也称为一碳代谢），因为它主要负责为细胞提供核苷酸供应、氨基酸稳态和S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）生成，对于快速增殖的细胞（如胚胎细胞和肿瘤细胞）至关重要。其中，亚甲基四氢叶酸脱氢酶2（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2， MTHFD2）是一种在胚胎组织和多种肿瘤中特异性高表达、但在大多数成年组织中表达水平很低的叶酸循环关键酶。尽管MTHFD2在支持肿瘤细胞增殖方面的代谢功能已被认识，但其是否参与调控细胞信号通路、进而影响肿瘤细胞与免疫系统相互作用，尚不清楚。

第三，详细研究流程与方法 本研究采用了一个从功能筛选到机制验证的综合性、多层次的研究策略，主要包含以下关键流程：

1. 基于CRISPR的功能筛选，鉴定出赋予肿瘤细胞抵抗T细胞杀伤能力的代谢基因。

   • 研究对象与方法：研究者使用了人转移性胰腺癌SW1990细胞系，利用一个涵盖所有代谢基因的sgRNA文库进行CRISPR/Cas9基因敲除筛选。
   • 实验流程：将文库病毒转导的SW1990细胞用嘌呤霉素筛选后，与来自健康人血液的活化CD8+ T细胞共培养。通过深度测序比较T细胞处理后残留细胞中每个sgRNA的丰度变化，并与平行对照组（未经T细胞处理）对比，以消除sgRNA对细胞基本活力的影响。
   • 数据分析：使用MAGeCK算法对3261个代谢基因进行Z-score评估。同时，结合一项先前关于19种人类肿瘤中基因表达谱的Meta分析数据（鉴定出3878个上调基因），筛选出既在肿瘤中高表达（Z-score > 3），其敲除又能使肿瘤细胞对T细胞杀伤更敏感（Z-score < -3）的基因。经过联合分析，最终从321个在肿瘤中极高表达（Z-score ≥ 15）的基因中，锁定了一个关键基因：MTHFD2。

2. 验证MTHFD2在促进肿瘤免疫逃逸中的功能及其临床相关性。

   • 功能验证：在SW1990细胞中，通过siRNA敲低或CRISPR敲除MTHFD2，并用乳酸脱氢酶（LDH）释放实验或实时细胞分析（xCelligence）检测T细胞介导的杀伤作用。结果显示，MTHFD2缺失显著加剧了多种癌细胞系（如SW1990、786-O、A549、MCF-7、HepG2、HCT-116）和鼠源胰腺癌PAN02-OVA细胞（使用OT-1小鼠脾细胞进行抗原特异性杀伤）的T细胞毒性死亡。
   • 临床相关性分析：查询癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库发现，MTHFD2 mRNA高表达与胰腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、肝癌患者的不良预后显著相关。

3. 探究MTHFD2促进免疫逃逸的机制：聚焦PD-L1。

   • 转录组分析：对MTHFD2敲低的SW1990细胞进行RNA-seq测序和基因集富集分析（GSEA）。结果显示，“免疫应答”相关基因集在敲低细胞中富集，提示MTHFD2参与调控癌细胞对免疫系统的反应。进一步分析发现，免疫检查点配体程序性死亡配体1（PD-L1） 的mRNA水平与MTHFD2在癌细胞（RNA-seq数据）和胰腺癌临床样本（TCGA数据）中均呈正相关。
   • 功能与调控验证：实验证实，MTHFD2敲低或敲除显著降低了多种癌细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中PD-L1的mRNA和蛋白表达水平，反之，过表达MTHFD2则能上调PD-L1表达及其启动子活性。流式细胞术（FACS）和重组PD-1蛋白结合实验证明，MTHFD2调控的是位于细胞膜上的功能性PD-L1。恢复性实验表明，在MTHFD2敲低的细胞中外源过表达PD-L1，可以逆转T细胞杀伤的加剧效应，而同时敲低MTHFD2和PD-L1则无明显叠加效应，表明MTHFD2主要通过上调PD-L1来保护肿瘤细胞免受T细胞攻击。

4. 解析干扰素-γ（IFN-γ）信号与MTHFD2-PD-L1轴的关系。

   • IFN-γ的调控作用：研究发现，在多种癌细胞中，MTHFD2不仅调控基础PD-L1表达，也参与IFN-γ诱导的PD-L1上调。更为重要的是，IFN-γ本身能显著诱导MTHFD2的表达。
   • 上游信号通路：机制研究表明，IFN-γ通过经典的AKT-mTORC1通路（而非STAT1通路）诱导MTHFD2的上调。同时，MTHFD2是IFN-γ刺激PD-L1表达的重要贡献者之一，与STAT1通路共同作用。

5. 阐明MTHFD2的代谢功能如何驱动PD-L1转录。

   • 催化活性依赖：过表达催化失活突变体MTHFD2-D168E无法像野生型一样有效上调PD-L1，表明其酶促活性是关键。
   • 代谢组学筛查：对MTHFD2敲低的癌细胞进行质谱代谢组学分析，发现一系列核苷及其衍生物发生改变，其中尿苷二磷酸（UDP）及相关代谢物尿苷三磷酸（UTP）显著下降。外源补充UTP或UDP能剂量依赖性地恢复PD-L1的mRNA和蛋白表达，并逆转MTHFD2敲低造成的抑制效应。
   • 连接O-GlcNAc糖基化修饰：进一步分析发现，尿苷相关代谢物中下降最显著的包括UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc），它是蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰的底物。MTHFD2敲低导致细胞整体蛋白O-GlcNAc修饰水平下降，而外源UTP/UDP可恢复之。过表达O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase, OGT）能逆转MTHFD2敲低引起的O-GlcNAc修饰下降、PD-L1表达抑制及T细胞杀伤加剧。
   • 临床验证：对73例连续的人类胰腺癌组织样本进行免疫组化分析，结果显示，肿瘤组织中的O-GlcNAc修饰水平与MTHFD2表达呈强正相关，也与PD-L1水平正相关，支持了上述机制的临床相关性。

6. 确定下游转录因子cMyc及其O-GlcNAc修饰的关键作用。

   • 转录因子筛查：对MTHFD2敲低的转录组数据进行GSEA分析，发现cMyc靶基因集在对照组细胞中富集，而在敲低细胞中不富集，提示MTHFD2维持cMyc的转录活性。已知cMyc可直接结合PD-L1启动子。
   • 机制探究：实验证实，cMyc敲低抑制PD-L1，而过表达cMyc能挽救MTHFD2敲低引起的PD-L1抑制。MTHFD2敲低不改变cMyc mRNA，但降低其蛋白水平，UTP/UDP可恢复之。
   • O-GlcNAc修饰稳定cMyc：先前质谱研究鉴定出cMyc蛋白Thr58位点可发生O-GlcNAc修饰，而该位点的磷酸化是导致cMyc被泛素化降解的关键事件。本研究发现，MTHFD2增强的UDP-GlcNAc供应，促进了cMyc Thr58位点的O-GlcNAc修饰。这种修饰与磷酸化竞争，从而稳定了cMyc蛋白，阻止其降解。突变该位点（T58A）的cMyc蛋白半衰期更长，且对OGT过表达或MTHFD2调控的稳定性变化不敏感。免疫共沉淀实验证实，MTHFD2能增强野生型cMyc（而非T58A突变体）的O-GlcNAc修饰和总蛋白水平。

7. 体内实验验证MTHFD2-PD-L1轴在肿瘤发生中的必要性。

   • 动物模型：将敲低MTHFD2的鼠胰腺癌PAN02细胞皮下注射到免疫缺陷的裸鼠和具有完整免疫系统的C57小鼠体内。
   • 结果：在裸鼠中，MTHFD2敲低仅中度抑制肿瘤生长；而在C57小鼠中，抑制效果极其显著（约80%），表明MTHFD2的促瘤作用很大程度上依赖于其对免疫系统的抑制。在C57小鼠模型中，MTHFD2敲低抑制了肿瘤组织内PD-L1的表达，促进了CD8+ T细胞和总CD45+免疫细胞的浸润。而在此模型中，外源过表达PD-L1能够有效逆转MTHFD2敲低导致的肿瘤生长抑制和免疫细胞浸润增加。这强有力地证明，MTHFD2通过上调PD-L1来促进体内肿瘤发生。

第四，主要研究结果 整个研究的结果环环相扣，逻辑链条清晰： 1. 筛选结果：通过CRISPR代谢基因功能筛选联合肿瘤表达谱分析，发现MTHFD2是唯一一个在肿瘤中极高表达、且其缺失会显著增强T细胞杀伤效应的基因。 2. 表型验证结果：在多种癌细胞系中验证了MTHFD2缺失增强T细胞毒性，且其高表达与患者不良预后相关。 3. 机制起点结果：转录组分析将MTHFD2与免疫检查点PD-L1联系起来，实验证实MTHFD2正调控PD-L1的转录和膜表达，且PD-L1是MTHFD2介导免疫逃逸的主要执行者。 4. 信号整合结果：发现肿瘤微环境关键因子IFN-γ能通过AKT-mTORC1通路上调MTHFD2，而MTHFD2又是IFN-γ诱导PD-L1表达的贡献者，从而将外部免疫信号与内部代谢调控联系起来。 5. 代谢-信号转换结果：证明MTHFD2的催化活性是必需的。代谢组学发现其下游关键代谢物UTP/UDP下降，且外源补充能恢复PD-L1。进一步追踪到UTP/UDP下游的UDP-GlcNAc和整体O-GlcNAc修饰水平下降，过表达OGT可逆转表型。 6. 下游效应结果：鉴定出转录因子cMyc是连接O-GlcNAc修饰与PD-L1转录的关键节点。MTHFD2通过提高UDP-GlcNAc水平，促进cMyc Thr58位点的O-GlcNAc修饰，该修饰与降解性磷酸化竞争，从而稳定cMyc蛋白，增强其转录活性，最终上调PD-L1。 7. 体内验证结果：动物实验证明，MTHFD2的促瘤作用在免疫健全小鼠中远强于免疫缺陷小鼠，且该作用可通过恢复PD-L1表达来挽救，确立了MTHFD2→PD-L1轴在体内肿瘤免疫逃逸中的核心地位和必要性。

第五，研究结论与价值 本研究得出核心结论：胚胎和肿瘤特异性表达的叶酸循环酶MTHFD2，除了已知的代谢功能外，发挥了一项新的、重要的非代谢功能——它通过驱动叶酸循环，维持足够的尿苷相关代谢物（特别是UDP-GlcNAc），进而促进包括cMyc在内的蛋白质的全局O-GlcNAc糖基化修饰；cMyc在Thr58位点的O-GlcNAc修饰增强了其蛋白稳定性，从而上调PD-L1的转录。这条“MTHFD2-叶酸循环-UDP-GlcNAc-O-GlcNAc修饰-cMyc稳定化-PD-L1上调”的信号轴，是肿瘤细胞实现免疫逃逸的重要机制。同时，MTHFD2本身又可被肿瘤微环境中的IFN-γ通过AKT-mTORC1通路上调，形成了一个促进免疫抵抗的正反馈环路。

其科学价值在于： 1. 揭示了代谢酶在肿瘤免疫调控中的新范式：首次系统阐明了MTHFD2这一典型代谢酶如何通过影响蛋白质翻译后修饰（O-GlcNAc）来调控关键的免疫检查点分子，架起了肿瘤代谢重编程与免疫逃逸信号通路之间的直接桥梁。 2. 拓展了对O-GlcNAc修饰功能的认识：提出O-GlcNAc修饰不仅是葡萄糖/谷氨酰胺的营养传感器，也受核苷酸代谢状态调控，并将此修饰的功能与转录因子稳定性和肿瘤免疫联系起来。 3. 深化了对IFN-γ“双刃剑”作用的理解：解释了IFN-γ在某些情况下促肿瘤的可能机制——即通过诱导MTHFD2来增强PD-L1介导的免疫抑制。

其应用价值在于： 1. 提出了新的联合治疗靶点：MTHFD2因其在正常成人组织中低表达（由MTHFD2L代偿），而在多种肿瘤中高表达，可能是一个相对安全的治疗靶点。靶向MTHFD2或其下游通路，有望克服由PD-L1补偿性上调导致的免疫治疗耐药。 2. 提供了潜在的疗效预测生物标志物：肿瘤组织中MTHFD2、O-GlcNAc修饰水平与PD-L1的相关性，可能作为预测免疫治疗响应的生物标志物。

第六，研究亮点 1. 创新性的研究视角与筛选策略：从“肿瘤细胞自身代谢如何赋予其免疫抵抗能力”这一独特视角出发，设计并执行了CRISPR功能筛选与肿瘤表达谱数据相结合的创新性筛选方案，高效锁定关键基因MTHFD2。 2. 完整且深入的机制解析：研究从表型到分子机制，从体外到体内，从代谢物到蛋白质修饰再到转录调控，构建了一个逻辑严密、证据链完整的信号通路（代谢→表观/转录→免疫表型），是交叉学科研究的典范。 3. 重要的新发现：首次报道了MTHFD2的非代谢功能，即调控PD-L1表达和肿瘤免疫逃逸；首次将cMyc的O-GlcNAc修饰（Thr58）与蛋白质稳定性及肿瘤免疫调控功能联系起来；明确了O-GlcNAc修饰受核苷酸代谢调控的新维度。 4. 强大的临床与体内验证：结合TCGA数据库分析、大量临床样本的免疫组化关联分析以及严谨的免疫健全/缺陷小鼠模型对比实验，使基础研究发现具有坚实的临床相关性和体内生理意义。

第七，其他有价值内容 本研究还暗示了MTHFD2可能在其他生物学过程中发挥更广泛的作用。例如，mTORC1已知能诱导核苷酸合成（通过MTHFD2），而本研究显示MTHFD2又能维持mTORC1的高活性和高蛋白质合成速率，这种相互增强的关系可能在细胞合成代谢中具有普遍意义。此外，鉴于MTHFD2在活化的T细胞等免疫细胞中也有表达，其在免疫生物学中的潜在功能值得进一步探索。这些都为后续研究开辟了新的方向。