T细胞耗竭新机制：线粒体功能障碍通过HIF-1α介导的糖酵解重编程驱动前体T细胞走向终末耗竭

本研究由以Martin Vaeth和Wolfgang Kastenmüller为共同通讯作者，Hao Wu为第一作者，来自德国维尔茨堡大学马克斯·普朗克系统免疫学研究组（Julius-Maximilians University of Würzburg）等多所研究机构的团队共同完成。该项研究成果已于2023年发表在《自然·通讯》（*Nature Communications*）期刊上。

一、学术背景与研究目的 T细胞耗竭（T cell exhaustion）是癌症和持续性感染中免疫应答失效的关键标志，其特征为抑制性受体（如PD-1, TIM-3, LAG-3）上调、细胞因子分泌减少及杀伤活性受损。虽然已知终末耗竭T细胞（terminally exhausted T cells, Tex）由一个具有自我更新能力的耗竭T前体细胞（precursor exhausted T cells, Tpex）群体持续补充，但调控Tpex细胞维持其“干性”以及驱动其向Tex细胞分化的内在分子机制，特别是代谢层面的调控原理，尚不完全清楚。既往研究表明，T细胞耗竭与线粒体功能下降相关，但这种代谢改变究竟是耗竭的结果还是原因，一直存在争议。因此，本研究旨在探究线粒体功能在T细胞耗竭中的因果作用及其具体的分子机制，并探索通过代谢干预增强T细胞（特别是用于癌症免疫治疗的CAR-T细胞）持久性与功能的潜在策略。

二、详细研究流程与方法 本研究采用了多层次、多技术的综合性研究策略，将体内外实验、遗传学模型、单细胞组学与代谢组学分析紧密结合。

1. 表型鉴定与代谢特征描绘：

   • 研究对象与处理： 研究首先利用慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13株（LCMV Cl13）感染小鼠模型，诱导体内CD8+ T细胞耗竭。在感染后第21天，通过流式细胞术分选出Ly108+ Tpex细胞和TIM-3+ Tex细胞。
   • 实验与方法：
     • 单细胞RNA测序（scRNA-seq）： 对来自慢性感染小鼠的CD44+ PD-1hi CD8+ T细胞进行scRNA-seq，通过无监督聚类和拟时序分析（Diffusion pseudotime, Slingshot）描绘Tpex到Tex的分化轨迹，并分析不同亚群的转录组特征。
     • 细胞能量代谢分析： 使用海马（Seahorse）细胞能量代谢分析仪，直接测量分选出的Tpex和Tex细胞的耗氧率（OCR，反映线粒体呼吸）和细胞外酸化率（ECAR，反映糖酵解），计算其糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）对ATP生产的相对贡献。
     • 线粒体功能与含量检测： 利用Mito-Dendra2报告基因小鼠，通过光转换技术追踪线粒体更新；使用MitoTracker和TMRE探针检测线粒体含量和膜电位；通过Western Blot和流式细胞术检测电子传递链（ETC）复合物及线粒体生物发生因子（如PGC-1α, TFAM）的表达。
   • 结果与逻辑推进： 此阶段工作明确了Tex细胞相较于Tpex细胞，呈现出线粒体基因表达下降、呼吸能力减弱、线粒体含量减少，但糖酵解活性增强的“瓦博格效应”样代谢重编程特征。这为“代谢改变是耗竭的关键特征”提供了证据，但因果关系尚未建立。

2. 建立因果关系的遗传学模型构建与验证：

   • 研究对象与处理： 为了直接验证线粒体功能障碍是否足以*引发*T细胞耗竭，研究团队构建了两个关键的T细胞特异性基因敲除小鼠模型。
     • MPIC缺陷模型（Slc25a3fl/fl Cd4Cre）： 敲除线粒体磷酸盐载体（MPIC），该蛋白负责将无机磷酸盐转运入线粒体基质，是ATP合成的限速步骤。此模型特异性导致T细胞线粒体ATP合成障碍。
     • TFAM缺陷模型（Tfamfl/fl Cd4Cre）： 敲除线粒体转录因子A（TFAM），严重损害线粒体DNA的转录与复制，从而抑制线粒体生物发生和氧化磷酸化。
   • 实验与方法：
     • 体外T细胞分化与功能分析： 分离野生型（WT）和基因敲除型（MPIC-/-或TFAM-/-） naïve CD8+ T细胞，在体外通过抗CD3/CD28抗体刺激，并分别在IL-2（诱导效应/细胞毒性T细胞，CTL）或IL-7/IL-15（诱导记忆样T细胞）条件下分化。评估其代谢表型（Seahorse）、抑制性受体表达（流式细胞术）、细胞因子（IFN-γ, TNF-α, IL-2）产生能力（细胞内染色）及存活率（Annexin V染色）。
     • 体内感染模型验证：
       • 急性感染模型（LCMV Armstrong）： 感染MPIC缺陷小鼠，观察在无持续抗原刺激的情况下，T细胞是否自发呈现耗竭表型。
       • 慢性感染竞争实验： 将带有不同荧光标记（如GFP+ vs TdTomato+）的WT和MPIC缺陷（或HIF-1α缺陷）的抗原特异性P14 T细胞（识别LCMV）以1：1比例共同过继转移给慢性感染（LCMV Cl13）的宿主小鼠。在感染后不同时间点，分析两组细胞在体内的扩增、存活、亚群比例（Tpex vs Tex）和功能。
       • 基因过表达挽救实验： 通过逆转录病毒载体在WT P14 T细胞中过表达MPIC，然后与空载体对照组细胞共同过继转移至慢性感染小鼠，评估增强线粒体呼吸是否能对抗耗竭。
   • 结果与逻辑推进： 研究发现，MPIC（或TFAM）缺陷的T细胞在体外活化后，即使在没有慢性刺激的情况下，也表现出糖酵解增强、抑制性受体（PD-1, TIM-3, LAG-3, Granzyme A）表达上调、细胞因子产生减少和凋亡增加等典型的耗竭特征。在体内，MPIC缺陷的T细胞在急性感染中表现出耗竭表型，在慢性感染竞争中处于劣势，Tpex细胞比例减少，Tex细胞比例增加。相反，过表达MPIC增强线粒体呼吸，能促进T细胞在慢性感染中的持久性并维持Tpex细胞比例。这些遗传学证据确凿地证明，线粒体功能障碍不仅是耗竭的伴随现象，而是驱动T细胞耗竭的细胞内在原因。

3. 分子机制探究：从代谢紊乱到转录重编程：

   • 研究对象与处理： 基于上述模型，深入研究MPIC缺陷导致耗竭的具体信号通路。
   • 实验与方法：
     • 代谢组学与稳定同位素示踪： 使用液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析WT和MPIC缺陷T细胞的代谢物谱。使用13C标记的葡萄糖进行代谢流分析，追踪糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖途径（PPP）的代谢通量。
     • 活性氧（ROS）检测： 使用CellROX（胞质ROS）和MitoSOX（线粒体ROS）荧光探针，通过流式细胞术检测细胞内ROS水平。
     • 转录组学与生物信息学分析： 对WT和MPIC缺陷T细胞进行RNA-seq，通过基因集富集分析（GSEA）、通路富集分析和转录因子预测，寻找关键的调控分子。
     • 关键蛋白检测与遗传互作： 通过流式细胞术和Western Blot检测缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的蛋白水平。构建MPIC与HIF-1α、或MPIC与NFATc1的双敲除小鼠（Slc25a3fl/fl Hif1afl/fl Cd4Cre; Slc25a3fl/fl Nfatc1fl/fl Cd4Cre），分析双缺陷T细胞的表型，以确定HIF-1α或NFATc1是否为MPIC缺陷诱导耗竭所必需。
     • 药理学干预： 使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）清除ROS，或使用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）限制糖酵解，观察是否能逆转MPIC缺陷T细胞的耗竭表型。
   • 结果与逻辑推进： 机制研究发现：
     • 代谢层面： MPIC缺陷导致线粒体ATP合成受阻，细胞通过增强糖酵解补偿能量需求。这导致葡萄糖大量流向糖酵解，减少了用于PPP的底物，进而降低了抗氧化剂NADPH的生成。
     • 氧化应激： NADPH减少导致细胞氧化还原稳态失衡，胞内ROS（包括线粒体ROS）水平显著升高。
     • HIF-1α稳定化： 升高的ROS抑制了脯氨酰羟化酶（PHDs）的活性，而PHDs在常氧下负责标记HIF-1α使其被蛋白酶体降解。因此，ROS积累导致了HIF-1α蛋白的异常稳定和积累，而非其基因表达上调。
     • 关键转录因子验证： 双敲除实验显示，NFATc1的缺失不能挽救MPIC缺陷导致的耗竭，而HIF-1α的缺失则能显著降低MPIC缺陷T细胞中PD-1、TIM-3、LAG-3等耗竭标志物的表达（但对Ly108的恢复有限），证明HIF-1α是连接线粒体功能障碍/ROS与耗竭表型的关键转录因子。用NAC清除ROS可降低HIF-1α蛋白水平并逆转耗竭表型。

4. HIF-1α的作用及其干预策略验证：

   • 研究对象与处理： 进一步明确HIF-1α在生理性耗竭过程中的作用，并测试靶向该通路的治疗潜力。
   • 实验与方法：
     • 单细胞水平验证： 对共同过继转移的WT和HIF-1α缺陷P14 T细胞进行scRNA-seq，分析在慢性感染背景下，HIF-1α缺失如何影响Tpex到Tex的分化轨迹和基因表达。
     • 代谢与功能分析： 比较WT和HIF-1α缺陷T细胞的糖酵解和OXPHOS活性。
     • 糖酵解抑制的干预研究：
       • 慢性感染模型： 将经2-DG短期预处理（24小时）的P14 T细胞与对照细胞共同转移至慢性感染小鼠，评估其持久性、亚群和功能。
       • 肿瘤模型： ①将2-DG预处理的卵清蛋白（OVA）特异性OT-1 T细胞过继转移给荷有表达OVA的MC38结肠癌的小鼠，评估抗肿瘤效果。②构建靶向人CD19的CAR-T细胞，经2-DG预处理后，过继转移至携带表达人CD19的MC38肿瘤的免疫缺陷（Rag1-/-）小鼠，评估其抗肿瘤活性和小鼠生存期。
   • 结果与逻辑推进： 单细胞测序证实，在慢性感染中，HIF-1α缺陷的T细胞更多地滞留在Tpex阶段，向Tex细胞的分化受阻。HIF-1α缺失导致糖酵解相关基因（如PFKL, ALDOA, GAPDH, PKM）表达下调，糖酵解能力减弱，但OXPHOS代偿性增强。最重要的是，短期使用2-DG抑制糖酵解，能在不影响T细胞功能的前提下，显著提高抗原特异性T细胞和CAR-T细胞在慢性感染和肿瘤模型中的持久性、维持Tpex细胞比例，并增强其抗肿瘤疗效。这为通过代谢工程改造T细胞，制造“抗耗竭”的T细胞产品提供了直接的概念验证和可行策略。

三、主要研究结果总结 本研究的核心发现可概括为一条清晰的信号轴：T细胞线粒体功能障碍 → 糖酵解代偿性增强导致PPP受限/NADPH减少 → ROS积累 → 抑制PHDs活性 → HIF-1α蛋白稳定化 → 驱动糖酵解重编程和耗竭相关基因转录 → 促进Tpex细胞向终末Tex细胞分化。每一步均有对应的遗传学（基因敲除/过表达）、药理学（NAC， 2-DG）、代谢组学、转录组学和功能学数据支持。

四、结论与研究价值 本研究的结论是：线粒体呼吸功能是维持Tpex细胞干性和功能的关键代谢基础。线粒体功能不全是一个细胞内在的、足以引发T细胞耗竭的触发因素，其通过ROS-HIF-1α轴驱动代谢重编程，从而加速T细胞的功能失调。 其科学价值在于： 1. 机制创新： 首次在遗传学上确立了线粒体功能障碍与T细胞耗竭之间的因果关系，并阐明了ROS-HIF-1α这一连接代谢压力与转录重编程的关键分子桥梁，深化了对免疫代谢与T细胞命运决定之间关系的理解。 2. 概念突破： 提出了线粒体功能充当T细胞耗竭“第二次打击”的理论，解释了为何在特定条件下（如持续抗原刺激叠加代谢压力）T细胞会不可逆地走向终末耗竭。 3. 应用前景明确： 研究直接指向了改善T细胞免疫疗法（尤其是CAR-T疗法）的新策略。通过增强T细胞的线粒体健康（如过表达MPIC）或短暂抑制其糖酵解重编程（如2-DG预处理），可以赋予T细胞更强的持久性和抗耗竭能力，从而提高其在对抗慢性感染和癌症中的疗效。这为“代谢工程”制造下一代免疫细胞产品提供了坚实的理论基础和实验依据。

五、研究亮点 1. 强因果性证明： 采用MPIC和TFAM两种不同机制的T细胞特异性敲除模型，从正反两面（功能缺失与功能获得）无可辩驳地证明了线粒体功能的中心地位。 2. 多层次技术整合： 将经典的免疫学模型、前沿的基因编辑动物、单细胞测序、代谢组学、代谢流分析等技术与细胞功能分析完美结合，构成了一个非常完整和严谨的证据链。 3. 从机制到转化： 研究不仅深入揭示了基础生物学机制（ROS-HIF-1α轴），还立即将发现转化为具有直接治疗潜力的干预策略（2-DG预处理），体现了转化医学的研究思路。 4. 对HIF-1α双重角色的深入探讨： 研究注意到了HIF-1α在T细胞功能中的复杂性，并通过对实验条件（如CD4+ T细胞剔除）的分析，为调和该领域看似矛盾的结果提供了新的视角。

六、其他有价值的内容 研究还通过分析公开数据库和自身数据，发现TGF-β信号可能通过抑制mTOR-HIF-1α轴来维持Tpex细胞，这与其他研究相呼应，暗示了代谢调控网络的复杂性。此外，对NFATc1作用的排除也是一个重要发现，它帮助将研究焦点精准定位到HIF-1α。这些细节共同绘制了一幅关于T细胞耗竭代谢调控的更为精细和动态的图谱。