关于PD-1选择性调控Akt与Ras通路从而调节细胞周期分子组分并抑制T细胞增殖的研究报告
本研究由来自哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心血液肿瘤及癌症生物学系的Nikolaos Patsoukis、Julia Brown、Victoria Petkova、Lequn Li和Vassiliki A. Boussiotis团队，以及来自新泽西州立大学罗格斯分校Ernest Mario药学院高级生物技术与医学中心及Susan Lehman Cullman癌症研究实验室的刘芳研究员合作完成。相关成果以标题“Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation”发表，最终编辑版本于《Science Signaling》期刊的第5卷第230期（论文号ra46）上刊出，并于2012年发布，后于2017年7月6日在PMC公开访问。
本研究属于免疫学，特别是T细胞免疫调节与信号转导领域。程序性死亡受体-1（Programmed Death 1, PD-1）是维持外周耐受、防止自身免疫的关键抑制性受体，但同时也削弱了抗病毒和抗肿瘤的T细胞反应。尽管PD-1抑制T细胞增殖的功能已很明确，但其如何影响细胞周期运转的分子机制尚不清楚。因此，本研究旨在探究PD-1信号如何通过调控细胞周期的分子控制器来抑制人类CD4+ T细胞的增殖。具体目标包括：确定PD-1对细胞周期G1期进程的影响；阐明其如何调控细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases, CDKs）的活性；探索上游信号通路（PI3K-Akt和Ras-MEK-ERK）在其中扮演的角色；并评估细胞因子白介素-2（IL-2）能否逆转PD-1的抑制效应。
研究采用高度纯化的人原代CD4+ T细胞作为研究对象，这是一个理想的生理模型，因为这些细胞天然处于细胞周期的G0期。核心实验流程涉及使用包被了特定单克隆抗体的磁珠来模拟体内刺激条件。磁珠共价连接有抗CD3（激活T细胞受体TCR-CD3复合物）、抗CD28（提供共刺激信号）的抗体，并同时连接抗PD-1的激动型抗体（实验组）或对照免疫球蛋白G（IgG，对照组）。这种“抗体包被磁珠”的方法是本研究的一个关键实验手段，它能够精确控制T细胞接收的激活信号与抑制信号，模拟了抗原提呈细胞表面配体与T细胞表面受体相互作用的情形。研究流程主要包含几个相互关联的部分：
细胞周期进程与增殖分析： 研究人员将CD4+ T细胞与上述磁珠共培养。通过BrdU类似物EdU（乙炔基脱氧尿苷）掺入实验和流式细胞术分析，评估DNA合成和细胞周期分布（G0/G1期 vs. S期）。同时，使用[³H]胸腺嘧啶掺入法测定细胞增殖水平。这些基础实验确认了PD-1交联能有效抑制DNA合成，将细胞阻滞在G0-G1期，并显著减少进入细胞周期的T细胞比例，而非仅仅延迟其进程。
排除TGF-β介导机制的验证实验： 鉴于PD-1曾被报道可增强转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β, TGF-β）的效应，而TGF-β本身是强效的增殖抑制剂，研究首先排除了PD-1通过增强内源性TGF-β产生或增加TGF-β受体（TGF-βR）表达/结合能力来发挥作用的可能性。他们通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清中的TGF-β分泌量，通过流式细胞术检测细胞内TGF-β水平，通过实时定量聚合酶链式反应（qPCR）检测TGF-βRI和TGF-βRII的mRNA表达量，并利用生物素化TGF-β1结合实验检测细胞表面的TGF-β结合能力。结果表明，无论是否存在PD-1信号，激活的T细胞产生和表面结合TGF-β的水平均无显著差异，甚至PD-1组在某些时间点的受体结合能力略低。这初步表明PD-1的细胞周期阻滞作用是独立于TGF-β产量或受体上调的。
细胞周期调控蛋白的表达与活性检测： 这是研究的核心分子生物学部分。研究人员在不同时间点收集细胞，制备全细胞裂解液，通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）系统分析了一系列细胞周期相关蛋白的表达和磷酸化状态。这包括：G1期细胞周期蛋白（Cyclin D1）、S期细胞周期蛋白（Cyclin E, Cyclin A）、CDKs（CDK4, CDK2）、CDK抑制剂（p27^Kip1^, p15^Ink4b^）、以及调控p27^Kip1^降解的泛素连接酶SCF^Skp2^的关键组分Skp2。此外，还检测了视网膜母细胞瘤蛋白（Retinoblastoma, Rb）的磷酸化（激活标志）以及CDK2的特异性底物——转录因子Smad3在Ser213位点的磷酸化（该磷酸化由CDK2催化，会抑制Smad3的活性）。为了确认CDK2的激酶活性，还进行了体外激酶实验，以组蛋白H1为底物，免疫沉淀CDK2后进行磷酸化分析。
Smad3转录活性与下游靶基因分析： 为了验证PD-1导致的Smad3低磷酸化是否增强了其转录功能，研究人员使用了报告基因检测法。他们将含有Smad结合元件（Smad Binding Element, SBE）的荧光素酶报告质粒转染入T细胞，通过检测荧光素酶活性来量化Smad3的转录活性。同时，通过qPCR和Western Blot检测了Smad3的两个经典转录靶点：其正向调控的CDK抑制剂p15^Ink4b^（由CDKN2B基因编码）和其负向调控的CDC25A磷酸酶（由CDC25A基因编码）。CDC25A能去磷酸化并激活CDKs，是细胞周期正调控因子。
功能验证实验（基因操控）： 为了确立Smad3和CDC25A在PD-1介导的增殖抑制中的因果关系，研究进行了功能获得和功能缺失实验。
上游信号通路分析： 为了阐明PD-1如何抑制Skp2的表达，研究深入探究了TCR-CD28激活下游的两条关键促增殖信号通路：PI3K-Akt通路和Ras-MEK-ERK通路。通过Western Blot检测了Akt（Thr308位点磷酸化）、其下游底物糖原合酶激酶-3β（GSK-3β，Ser9位点磷酸化）、MEK1/2、ERK1/2（Thr202/Tyr204位点磷酸化）的激活状态。特别地，为了直接评估Ras的激活，使用了基于GST-Raf1-RBD融合蛋白的Pull-down实验，特异性捕获并检测激活态（GTP结合态）的Ras。同时，也检测了另外两条MAPK通路——p38和JNK的激活情况，作为对照。
IL-2的挽救实验： 鉴于IL-2是关键的T细胞生长因子，且已知能部分逆转PD-1的抑制，研究探讨了外源性IL-2的作用机制。在PD-1共刺激的培养体系中加入IL-2，观察其对上述PI3K-Akt和MEK-ERK信号通路的恢复情况，以及对Skp2蛋白表达和细胞增殖的挽救效果。作为阳性对照，还使用了佛波酯PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate）直接激活Ras和Akt信号，观察能否完全恢复Skp2和增殖。
数据分析方面，细胞增殖和报告基因实验数据采用Student’s t检验或方差分析（ANOVA）进行统计学比较。Western Blot和qPCR结果通过重复实验和密度计量分析进行验证。
本研究取得了系列重要且相互印证的实验结果：
PD-1通过抑制Skp2表达导致p27^Kip1^积累和CDK2失活： Western Blot和qPCR数据显示，PD-1信号显著抑制了Skp2在mRNA和蛋白水平的诱导表达。这直接导致其底物p27^Kip1^的降解受阻，细胞内p27^Kip1^蛋白大量积累。同时，p27^Kip1^在Thr187位点的磷酸化（这是被SCF^Skp2^识别并泛素化的关键步骤）也大幅减弱。积累的p27^Kip1^有效地抑制了CDK2的活性，表现为CDK2的Thr160位点磷酸化水平降低，以及体外激酶活性下降。尽管Cyclin E和CDK2的蛋白表达量未受PD-1明显影响，但其复合物的功能被p27^Kip1^有效遏制。
CDK2失活引发下游级联反应： 失活的CDK2无法有效磷酸化其两个关键底物：
活化的Smad3重塑细胞周期调控网络： 增强的Smad3转录活性直接调控其下游靶基因：
Smad3是PD-1下游的关键效应分子： 通过shRNA敲低Smad3，PD-1诱导的p15^Ink4b上调被显著削弱，同时PD-1的抗增殖效应也大幅减弱，这直接证明了Smad3是PD-1信号通路中不可或缺的组分。
PD-1选择性抑制PI3K-Akt和Ras-MEK-ERK通路： 上游信号分析揭示了PD-1作用的起点。PD-1交联后，TCR-CD28激活所诱导的Akt（Thr308）和GSK-3β（Ser9）磷酸化被持续抑制。更重要的是，研究发现PD-1能选择性抑制MAPK通路：它强烈抑制了MEK1/2和ERK1/2的磷酸化激活，但对p38和JNK的激活没有影响。进一步的Ras激活（Pull-down）实验发现，PD-1导致Ras的激活变得短暂且迅速衰减，而正常激活组则是持续而稳健的Ras激活。由于Skp2的转录诱导同时依赖于PI3K-Akt和Ras-MEK-ERK信号，PD-1对这两条通路的双重抑制完美解释了其对Skp2表达的阻断。
IL-2仅能部分逆转PD-1的抑制作用： 挽救实验提供了重要的机制见解和临床启示。外源性IL-2的加入，能够部分恢复被PD-1抑制的MEK-ERK信号通路，但对PI3K-Akt通路无恢复作用。与此对应，IL-2也只能部分恢复Skp2的蛋白表达和T细胞的增殖能力。相比之下，能同时强力激活Ras和Akt通路的PMA，则可以完全恢复Skp2表达和细胞增殖。这表明PD-1通过独立于和依赖于IL-2的双重机制来抑制T细胞扩增：既通过抑制TCR信号本身（影响Akt和Ras），也通过抑制IL-2R下游的信号（主要影响Akt通路）。这解释了为何单独补充IL-2在临床上可能不足以完全克服PD-1/PD-L1介导的T细胞耗竭。
本研究得出结论：PD-1通过选择性抑制TCR-CD28激活下游的PI3K-Akt和Ras-MEK-ERK信号通路，阻断细胞周期关键调节因子Skp2的转录。这导致CDK抑制剂p27^Kip1^积累，进而抑制CDK2激酶活性。失活的CDK2一方面无法磷酸化Rb以驱动细胞进入S期，另一方面无法抑制转录因子Smad3，反而增强了Smad3的活性。活化的Smad3进而上调另一个CDK抑制剂p15^Ink4b，并抑制/降解CDK激活磷酸酶CDC25A。这些事件共同在细胞周期G1期及G1/S转换点建立了多层次的抑制关卡，最终导致T细胞增殖被有效阻滞。
本研究的科学价值在于首次系统、深入地阐明了PD-1抑制T细胞增殖的完整分子通路图谱，将上游的信号抑制（PI3K-Akt, Ras-MEK-ERK）与下游的细胞周期核心机器（Skp2/p27^Kip1^/CDK2/Smad3/p15^Ink4b/CDC25A）精确地连接起来。它揭示了PD-1不仅是简单的“刹车”信号，而是能够重塑细胞周期调控网络的精密控制器。应用价值方面，该研究为理解PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗中的机制提供了基础理论支持，并解释了为何单用IL-2疗法可能效果有限——因为PD-1同时阻断了IL-2R下游的关键促存活/增殖通路（特别是Akt）。这为开发联合疗法（如检查点抑制剂联合其他能激活Akt或下游细胞周期靶点的药物）提供了理论依据。同时，研究也阐明了PD-1在维持外周耐受和诱导T细胞无能中的核心作用机制。
本研究的亮点在于： 1. 研究设计的系统性： 从现象（细胞周期阻滞）到机制（信号通路、转录调控、蛋白修饰与降解），再到功能验证（基因敲低与突变体回补），构建了完整的证据链。 2. 机制的创新性发现： * 首次将PD-1信号与Smad3的转录活性调控直接联系起来，并明确其不依赖于TGF-β，而是通过CDK2介导的磷酸化来调节。 * 揭示了PD-1对CDC25A的双重调控：既抑制转录，又促进蛋白降解。 * 明确了PD-1对MAPK通路的选择性抑制（抑制ERK，不抑制p38/JNK），并首次将PD-1与Ras信号的快速衰减相关联。 * 阐明了IL-2只能部分逆转PD-1抑制的深层信号机制。 3. 技术方法的严谨性： 使用了原代人CD4+ T细胞这一生理相关模型，并结合了抗体包被磁珠这一可控的刺激系统、多种分子生物学技术以及功能性基因操控实验，确保了结论的可靠性。 4. 结论的整合性与启发性： 最终提出了一个整合性的模型（论文中的图7），清晰概括了PD-1调控细胞周期的级联反应网络，对该领域的研究具有重要的指导意义。
此外，研究中对TGF-β非依赖机制的验证、对泛素-蛋白酶体系统参与的揭示，以及对IL-2信号挽救能力的精准剖析，都是极具价值的发现，深化了我们对免疫检查点生物学功能的理解。