关于PD-1信号调控肿瘤浸润性调节性T细胞命运稳定性的研究学术报告
一、 作者与发表信息
本研究由Myeong Joon Kim和Kyungsoo Kim（并列第一作者）以及Insuk Lee和Sang-Jun Ha（并列通讯作者）领导，联合团队来自延世大学（Yonsei University）生命科学与生物技术学院的生物化学系和生物技术系，以及汉阳大学（Hanyang University）生命科学系、自然科学研究所等机构。该研究成果于2023年1月以论文形式发表在学术期刊《自然·免疫学》（*Nature Immunology*）的第24卷第148-161页，论文标题为“Deletion of PD-1 destabilizes the lineage identity and metabolic fitness of tumor-infiltrating regulatory T cells”，数字对象识别符（DOI）为10.1038/s41590-022-01373-1。
二、 学术背景与立题依据
本研究属于肿瘤免疫学和免疫代谢学交叉领域，核心焦点在于探究免疫检查点分子程序性死亡受体-1（PD-1）在肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中调节性T（Regulatory T, Treg）细胞上的功能。Treg细胞通过抑制效应性T细胞来维持免疫耐受，防止自身免疫病，但在肿瘤微环境中，Treg细胞的过度积累和强大抑制功能会导致抗肿瘤免疫应答受损，与癌症患者的不良预后相关。PD-1是关键的免疫检查点，其抗体疗法已在多种癌症中取得显著疗效。然而，PD-1的功能研究主要集中在CD8⁺ T细胞上，而Treg细胞也高表达PD-1，但PD-1在Treg细胞，特别是在肿瘤浸润（Tumor-Infiltrating, TI）Treg细胞中的功能存在长期争议：部分研究认为PD-1促进Treg细胞的稳定和功能，而另一些研究则认为PD-1抑制Treg细胞功能，类似于其在效应T细胞中的作用。
这种矛盾的存在阻碍了对PD-1抗体疗法完整作用机制的深入理解。例如，除了直接“解救”功能耗竭的效应T细胞外，PD-1抗体是否也通过影响TME中的Treg细胞来发挥作用？为了澄清这一关键问题，并深入理解PD-1如何塑造Treg细胞在肿瘤中的特性，本研究团队设定了明确的研究目标：通过在Treg细胞中条件性敲除PD-1，并结合单细胞多组学分析，系统性地探究PD-1信号对TI-Treg细胞的谱系稳定性、增殖能力、抑制功能以及代谢适应性等方面的调控作用及其内在机制。
三、 详细研究流程与实验设计
本研究采用了严谨的基因工程小鼠模型、体内外功能实验以及先进的单细胞测序技术，流程环环相扣，逻辑缜密。主要流程可概括为五个核心阶段：
第一阶段：构建并验证Treg细胞特异性PD-1条件性敲除小鼠模型 研究团队构建了Pdcd1fl/flFoxp3eGFP-Cre-ERT2小鼠。该模型在Foxp3启动子下游插入eGFP-Cre-ERT2融合蛋白，Foxp3阳性的Treg细胞同时表达eGFP和Cre-ERT2。Cre-ERT2是一种他莫昔芬（Tamoxifen， Tam）诱导的Cre重组酶，仅在Tam注射后激活。在Tam处理的Pdcd1fl/flFoxp3eGFP-Cre-ERT2小鼠（简称PD-1cKO）中，Cre-ERT2会特异性删除Treg细胞中Pdcd1基因的loxP位点，从而实现PD-1的条件性敲除。以注射溶剂的同窝小鼠作为对照组（PD-1cTr）。通过流式细胞术，研究人员确认Tam处理后，PD-1cKO小鼠中约80%的Treg细胞丢失PD-1表达，而其他免疫检查点分子（如Tim3、TIGIT、LAG-3）的表达及CD8⁺、CD4⁺常规T（Tconv）细胞的PD-1表达均不受影响，证明了该模型的特异性。此外，通过Pdcd1fl/flFoxp3eGFP-Cre-ERT2(+/-)杂合子小鼠模型，可在同一只小鼠体内同时存在PD-1野生型（PD-1wt）和PD-1敲除型（PD-1ko）的Treg细胞，用于进行细胞自主性（cell-intrinsic）功能比较，排除了微环境差异的干扰。
第二阶段：评估PD-1缺失对慢性病毒感染和肿瘤生长的影响 首先，在慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV-Cl13）感染模型中，PD-1cKO小鼠表现出更强的病毒控制能力，其病毒特异性CD8⁺ T细胞产生更多细胞因子，而Treg细胞的Foxp3表达降低，增殖减弱，表明PD-1缺失削弱了Treg稳定性并增强了抗病毒免疫。接着，在TC-1（肺鳞癌）和B16F10（黑色素瘤）两种小鼠肿瘤模型中，PD-1cKO小鼠的肿瘤生长显著延迟，生存期延长。分析肿瘤免疫浸润发现，PD-1cKO小鼠的肿瘤内Treg细胞（TI-Treg）频率和绝对数量均显著减少，导致CD8⁺ T细胞/Treg细胞比值升高。然而，肿瘤内CD8⁺和CD4⁺ Tconv细胞的数量并无显著变化。这表明PD-1缺失对肿瘤生长的抑制作用主要与减少TI-Treg细胞池有关。
第三阶段：深入探究PD-1缺失导致TI-Treg减少的内在机制 为了解释TI-Treg减少的原因，研究者进行了细致的表型和功能分析。流式细胞术检测显示，与对照相比，PD-1cKO小鼠的TI-Treg细胞（而非脾脏Treg）表现出： 1. 增殖能力（Ki67⁺）下降，凋亡（Annexin V⁺7-AAD⁺）增加。 2. 谱系稳定性相关标志物下调：包括转录因子Foxp3、Blimp1，以及功能分子CTLA-4、CD103、CD25的表达均显著降低。 3. 抑制功能受损：从肿瘤分离的CD8⁺和CD4⁺ T细胞在体外再刺激时，PD-1cKO组产生更多的IFN-γ、TNF和IL-2，表明Treg细胞的抑制能力减弱。
更重要的是，使用Pdcd1fl/flFoxp3eGFP-Cre-ERT2(+/-)小鼠，在同一肿瘤微环境中直接比较PD-1wt和PD-1ko Treg细胞，得出了相同的结论：PD-1ko Treg细胞更易凋亡、增殖更弱，且稳定性标志物表达更低。这以最严谨的方式证明了PD-1对TI-Treg稳定性的调控是细胞自主性的。
第四阶段：利用谱系追踪和功能实验验证PD-1对Treg稳定性的关键作用 为了直接观察PD-1缺失是否导致Treg细胞失去Foxp3表达（即去稳定性，变成ex-Treg），研究团队引入了Rosa26tdTomato报告基因小鼠。在Pdcd1fl/flFoxp3eGFP-Cre-ERT2Rosa26tdTomato（PD-1cKO;tdTomato）小鼠中，Tam诱导后，Foxp3⁺细胞会永久表达tdTomato（红色荧光），即使后续丢失Foxp3（eGFP⁻），红色标记依然存在。结果显示，在PD-1cKO;tdTomato小鼠的肿瘤中，tdTomato⁺eGFP⁻（即ex-Treg）细胞的比例显著高于对照，而在脾脏中无此差异。同样，在PD-1cKO;tdTomato小鼠肿瘤内，PD-1⁻的tdTomato⁺ Treg细胞比PD-1⁺的tdTomato⁺ Treg细胞含有更高比例的ex-Treg。这些数据确凿地证明PD-1信号是维持TI-Treg细胞Foxp3表达和谱系稳定所必需的。
进一步的体外抑制实验表明，从肿瘤中分选的CD25⁺PD-1⁻ Treg细胞比CD25⁺PD-1⁺ Treg细胞对CD8⁺ T细胞增殖的抑制能力更弱。体内过继转移实验也证实，来自PD-1cKO小鼠脾脏的Treg细胞其抑制自身免疫反应的能力也弱于对照组Treg细胞。
第五阶段：单细胞转录组与TCR测序揭示PD-1调控的分子网络 这是本研究的核心机制探索环节。研究者对PD-1cKO小鼠肿瘤中的CD4⁺ T细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞TCR测序（scVDJ-seq）。关键发现如下： 1. 转录谱差异：UMAP降维分析显示，PD-1wt和PD-1ko TI-Treg细胞形成明显不同的簇，表明其整体转录状态存在显著差异。 2. 通路富集分析：基因集变异分析（GSVA）显示，与PD-1wt TI-Treg相比，PD-1ko TI-Treg细胞中与增殖、抑制功能和趋化性相关的基因集活性显著降低。 3. 克隆扩增：scVDJ-seq分析揭示了决定性证据。PD-1wt TI-Treg细胞中存在显著的克隆扩增（即多个细胞共享同一个TCR序列），而PD-1ko TI-Treg细胞基本只包含独特的、非扩增的克隆。克隆不平等性指数（Gini index）在PD-1ko TI-Treg中也显著降低。这表明PD-1信号对于TI-Treg细胞在肿瘤微环境中的选择性扩增和克隆优势维持至关重要。 4. 代谢重编程：代谢通路分析是本研究的一大亮点。GSVA和基因集富集分析（GSEA）均显示，与脂质代谢、脂肪酸氧化、PPAR-β信号通路靶基因以及氧化磷酸化相关的基因集在PD-1wt TI-Treg细胞中显著富集。热图分析也证实了PPAR-β靶基因及脂代谢关键基因在PD-1wt细胞中高表达。对应的功能实验证实，TI PD-1ko Treg细胞的脂质摄取能力和线粒体质量均低于PD-1wt Treg细胞。这表明PD-1信号通过促进脂质代谢和线粒体氧化磷酸化，为TI-Treg细胞在营养匮乏且富含乳酸的TME中提供了关键的代谢适应性，从而支持其存活、增殖和功能。
四、 主要研究结果与结论
综合所有实验结果，本研究得出以下核心结论： 1. PD-1是维持TI-Treg细胞谱系稳定性和功能的关键分子。条件性敲除Treg细胞上的PD-1，会导致肿瘤内Treg细胞数量减少、Foxp3表达下调、增殖能力下降、凋亡增加，最终削弱其免疫抑制功能，从而增强抗肿瘤免疫，延缓肿瘤进展。 2. PD-1对TI-Treg的调控是细胞自主性的。在同一小鼠、同一肿瘤微环境中，PD-1ko Treg细胞的表现始终逊于其PD-1wt的“邻居”，排除了系统性或微环境差异的影响。 3. PD-1通过调控代谢重编程来保障TI-Treg的适应性。机制上，PD-1信号不依赖于SREBP通路，而是通过促进与脂质代谢和氧化磷酸化相关的基因表达程序，增强TI-Treg细胞的代谢适应能力，这是其维持克隆扩增、生存和抑制功能的基础。 4. PD-1抗体治疗部分通过靶向Treg细胞发挥作用。在TC-1肺癌模型中，PD-1抗体治疗降低了PD-1wt小鼠（而非PD-1cKO小鼠）的TI-Treg细胞数量和Foxp3表达，但对TI CD8⁺ T细胞细胞因子产生的直接“解救”作用不明显。这表明在该模型中，PD-1抗体的疗效可能更多源于削弱Treg细胞的稳定性，而非直接逆转CD8⁺ T细胞耗竭。这为理解PD-1抗体疗法的异质性响应提供了新视角。
五、 研究的意义与价值
本研究的科学价值在于： * 解决了领域内一个重要争议：明确揭示了在肿瘤微环境这一特定背景下，PD-1信号对Treg细胞的作用是正向促进其稳定和功能，而非抑制。这澄清了先前相互矛盾的研究发现，可能归因于不同的疾病模型、Treg细胞发育阶段或实验系统。 * 揭示了PD-1抗体疗法的新机制：提出了PD-1抗体增强抗肿瘤免疫的一条此前被低估的途径——通过破坏TI-Treg细胞的代谢适应性和稳定性来减少其数量。这解释了为何在某些情况下（如CD8⁺ T细胞已深度耗竭），PD-1抗体仍能通过作用于Treg细胞而生效。 * 建立了Treg细胞功能与代谢调控的直接联系：将PD-1信号、脂质代谢重编程和Treg细胞的命运稳定性紧密联系起来，丰富了肿瘤免疫代谢领域的知识体系。 * 提供了潜在的治疗策略：研究提示，靶向TI-Treg细胞特有的代谢依赖途径（如脂代谢），可能与PD-1抗体产生协同抗肿瘤效应。
六、 研究亮点
Foxp3eGFP-Cre-ERT2与Pdcd1fl/fl、Rosa26tdTomato小鼠的组合使用，实现了高特异性、可诱导的Treg细胞PD-1敲除和精准的谱系追踪，是得出可靠结论的技术基石。七、 其他有价值的发现
研究还探讨了PD-1功能的背景依赖性。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，PD-1cKO小鼠的疾病严重程度较轻，但其Treg细胞的Foxp3表达同样下降。深入分析发现，PD-1缺失导致自身反应性T细胞在肺部异常活化和滞留，反而减少了向中枢神经系统的浸润，这可能是疾病减轻的原因。这一发现强调了PD-1在Treg细胞上的功能可能因组织微环境和疾病类型而异，提示需要进行更广泛的背景特异性研究。此外，研究还发现，在肿瘤已建立后再敲除PD-1，其抗肿瘤效果减弱，提示PD-1信号对Treg细胞的调控在早期激活和扩增阶段更为关键，这对优化免疫治疗时机具有启示意义。