关于LAG3免疫检查点激活机制及其临床转化潜力的研究报告
一、 研究团队、发表信息与学术背景
本研究由上海科技大学的王浩鹏教授、中国科学院生物化学与细胞生物学中心的许琛琦教授、美国匹兹堡大学的Dario A.A. Vignali教授、北京大学肿瘤医院的孔燕教授以及百济神州的沈志荣博士作为共同通讯作者领导，第一作者包括蒋勇、戴安然、黄宇威、李华、崔健和杨皓晨等人。该研究成果于2025年5月1日以开放获取形式发表在顶级学术期刊《Cell》（第188卷，第2354–2371页），标题为《配体诱导的泛素化通过阻碍信号基序的膜隔离来释放LAG3免疫检查点功能》。
Lymphocyte Activation Gene 3 (LAG3，淋巴细胞活化基因3) 是继CTLA-4和PD-1之后，第三个在临床上被证实有效的免疫检查点分子。针对LAG3的阻断性抗体Relatlimab已获FDA批准用于治疗黑色素瘤，与抗PD-1抗体联合使用展现出显著疗效。然而，与PD-1等研究较为深入的检查点分子不同，LAG3在配体（如MHC II类分子、FGL1）结合后如何被激活并传递抑制信号的分子机制一直不甚明了。这种机制的缺失，阻碍了针对LAG3的更合理、更有效的疗法开发以及预测疗效的生物标志物的发现。因此，本研究旨在揭示LAG3在配体结合后被激活的分子机制，并探索其临床转化潜力。
二、 研究目标
本研究的主要目标是：1）探究LAG3在配体结合后是否发生以及发生何种翻译后修饰（Post-translational Modification， PTM）；2）阐明这种修饰如何调控LAG3的抑制功能；3）验证该修饰在肿瘤免疫抑制中的关键作用；4）探索基于该机制的LAG3功能评估方法和潜在的临床生物标志物。
三、 详细研究流程与实验设计
本研究采用了从分子机制到动物模型，再到临床数据验证的多层次、系统性研究策略。
流程一：发现配体诱导的LAG3泛素化 首先，研究者建立了一个成熟的T细胞-抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cell， APC）共培养系统。他们将人源LAG3异位表达在不表达内源性LAG3的Jurkat T细胞中，并与表达MHC II类分子（LAG3的主要配体）的Raji B细胞共培养，同时用超抗原刺激T细胞受体（TCR）。通过免疫沉淀-质谱联用技术（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry， IP-MS）分析激活状态与静息状态下LAG3的翻译后修饰差异。质谱结果显示，在激活的T细胞中，LAG3胞质尾区第498位的赖氨酸（K498）发生了泛素化修饰。通过免疫印迹（Western Blot）进一步证实，这种修饰是多聚泛素化，且具有时间依赖性，在刺激后2分钟即可检测到，5分钟达到峰值，30分钟后回落至基线。重要的是，这种泛素化是配体依赖性的，因为使用阻断LAG3与MHC II结合的抗体Relatlimab，或使用无法结合MHC II的LAG3突变体（P115A），均能完全消除泛素化。研究者还通过点突变（K498R）和构建基因敲入小鼠（Lag3K490R，对应小鼠的K490位点），证实K498/K490是LAG3唯一的泛素化位点，且在小鼠原代CD4+和CD8+ T细胞中同样存在配体诱导的泛素化。
流程二：探究FGL1作为配体的作用 鉴于FGL1作为LAG3配体存在争议，研究者测试了其诱导泛素化的能力。他们发现，可溶性的FGL1-Fc融合蛋白可以诱导较弱的LAG3泛素化并抑制IL-2产生，但这种作用依赖于Fc受体介导的膜结合。当使用无法有效结合细胞膜的His标签FGL1或使用Fc受体阻断抗体时，泛素化被抑制。这表明，膜结合形式的FGL1（如由APC或肿瘤细胞表达）才能有效发挥LAG3配体功能，而可溶性FGL1可能作用较弱或需要其他机制辅助。
流程三：阐明泛素化的类型与功能后果 通常，受体泛素化会导致其降解。然而，本研究通过比较野生型（WT）和K498R突变型LAG3在激活过程中的表达水平和蛋白半衰期，发现泛素化并不影响LAG3的稳定性或降解。进一步分析泛素链类型发现，LAG3的泛素化主要是非K48连接的多聚泛素化（包括K63连接和可能的K11连接），而非介导降解的K48连接链。功能实验表明，无法被泛素化的LAG3-K498R突变体，其抑制T细胞产生IL-2的能力显著减弱。这首次揭示了一种非降解性的、正向调控LAG3抑制功能的泛素化修饰。
流程四：鉴定介导LAG3泛素化的E3连接酶 为了寻找催化LAG3泛素化的E3泛素连接酶，研究者将TurboID（一种酶促邻近标记技术）融合到LAG3的C端。通过在激活与静息状态下进行生物素标记和质谱分析，他们筛选出在激活状态下特异性与LAG3相互作用的泛素化通路相关蛋白。结果显示，Cbl家族的E3连接酶C-Cbl和Cbl-B被显著富集。随后的基因敲除实验证实，在Jurkat T细胞或人原代T细胞中，单独敲除C-Cbl或Cbl-B均不能完全消除LAG3泛素化，但双敲除则使其完全消失。回补任一酶均可恢复泛素化。体外泛素化实验进一步证明C-Cbl可以直接催化LAG3泛素化。功能上，C-Cbl/Cbl-B双敲除的T细胞也丧失了LAG3介导的抑制功能。这表明Cbl家族E3连接酶冗余地介导了LAG3的泛素化，并对其功能至关重要。
流程五：揭示泛素化激活LAG3的分子机制 LAG3胞质尾区含有一个进化保守的富含碱性残基的序列（Basic Residue-Rich Sequence， BRS motif），其后紧跟着关键的抑制信号基序“FSALE”。研究者推测，BRS可能通过与带负电的细胞膜磷脂相互作用，将FSALE基序“锚定”在细胞膜上，使其无法发挥信号功能。通过核磁共振（NMR）光谱、芳香族荧光发射（AFE）和荧光偏振（FP）等生物物理技术，他们证实：1）LAG3的N端胞质区（包含BRS和FSALE）能够特异性结合模拟细胞膜内叶脂质组成的囊泡；2）NMR数据显示FSALE基序中的关键残基（F483， L486）位于脂质双分子层的疏水内部，即该基序被“埋藏”在膜中。当在LAG3肽段的K498位点连接一个泛素分子以模拟泛素化后，其与膜的结合能力显著下降。在细胞中，通过在LAG3跨膜区和BRS之间插入一个10个氨基酸的柔性连接子（Lag3-10aa），人为地将FSALE基序与膜空间分离，结果发现该突变体的抑制功能反而大大增强。更重要的是，在无法泛素化的Lag3-KR突变体上插入这个连接子，可以完全恢复其抑制功能。这些结果共同表明，配体结合诱导的Cbl介导的泛素化，通过在K498位点添加庞大的泛素链，产生空间位阻，迫使LAG3的BRS-FSALE序列从细胞膜上解离，从而暴露出FSALE抑制基序，启动LAG3的抑制信号。
流程六：验证泛素化在体内抗肿瘤免疫中的关键作用 研究者利用构建的Lag3K490R基因敲入小鼠，在体内验证了LAG3泛素化的生理功能。与Lag3基因敲除（KO）小鼠类似，Lag3KR小鼠的T细胞在体外抗原刺激下，其IL-2等细胞因子的产生抑制被解除，增殖能力增强。在两种小鼠肿瘤模型（MC38结肠癌和B16黑色素瘤）中，单独使用抗PD-1治疗时，Lag3KR小鼠和Lag3 KO小鼠都表现出比野生型小鼠更显著的肿瘤生长抑制和生存获益，肿瘤浸润T细胞的数量和功能（如IFN-γ产生）也更高。这表明，阻断LAG3的泛素化，在功能上等同于敲除LAG3，能够有效增强抗肿瘤免疫。
流程七：探索临床转化价值——生物标志物与治疗评估 1. 作为治疗性抗体效力的生物化学读数：研究者测试了7种处于临床研发阶段的LAG3阻断抗体。结果显示，所有具有功能阻断活性的抗体都能显著抑制LAG3的泛素化，且其抑制泛素化的能力与它们在功能实验中恢复IL-2产生的能力（EC50）高度正相关。这提示LAG3泛素化水平可以作为评估LAG3靶向药物活性的一个直接分子读数。 2. 作为预测性生物标志物：研究者构建了LAG3人源化小鼠模型，并在肿瘤微环境（TME）中直接检测到LAG3的泛素化，且这种泛素化可被FDA批准的LAG3抗体阻断。通过对黑色素瘤临床试验（NCT03743766）的单细胞RNA测序数据进行分析，他们发现LAG3和Cbl家族基因在耗竭性T细胞中协同高表达。生存分析（TCGA-SKCM数据集）显示，在LAG3高表达的黑色素瘤患者中，若同时高表达Cbl，则总生存期显著更差。对接受过抗PD-1/LAG3联合治疗的黑色素瘤患者样本进行多重免疫荧光分析发现，肿瘤组织中LAG3和Cbl蛋白共阳性的细胞数量，在从治疗中获益（疾病稳定或部分缓解）的患者中，比在未获益（疾病进展）的患者中高出51.7倍，而仅用LAG3阳性作为标志物的差异则不显著。这表明 “LAG3+Cbl+” 可能是一个优于单独“LAG3+”的、用于筛选可能对LAG3阻断疗法有响应的患者的预测性生物标志物。
四、 主要研究结果与逻辑关系
本研究取得了一系列环环相扣的重要发现： 1. 发现现象：首次发现LAG3在配体（MHC II或膜结合FGL1）结合后，发生快速、瞬时的非降解性多聚泛素化（K63连接为主），修饰位点为保守的K498（人）/K490（鼠）。 2. 鉴定酶类：通过TurboID邻近标记技术，鉴定出Cbl家族E3连接酶（C-Cbl和Cbl-B）冗余地介导了这一泛素化过程。 3. 阐明功能：该泛素化正向调控LAG3的抑制功能，而非导致其降解。功能缺失（K498R突变或Cbl双敲除）会显著削弱LAG3对T细胞活化的抑制。 4. 揭示机制：通过生物物理和细胞生物学手段，揭示了泛素化激活LAG3的分子机制：泛素链的添加产生的空间位阻，破坏了LAG3胞内区BRS与细胞膜酸性磷脂的相互作用，从而将关键的FSALE抑制基序从膜中“释放”出来，使其能够行使信号功能。人为增加BRS与膜的距离（10aa插入）可模拟并增强这一效应。 5. 验证生理意义：在基因敲入小鼠模型中证实，阻断LAG3泛素化（Lag3KR）能有效增强抗肿瘤免疫，其效果与敲除LAG3相当。 6. 探索转化应用：提出并初步验证了LAG3泛素化可作为评估LAG3靶向药物效力的生物化学指标，以及“LAG3与Cbl共表达”作为预测LAG3阻断疗法响应的潜在生物标志物。
这些结果逻辑严密：从发现修饰现象，到寻找催化酶，再到阐明该修饰如何从物理和功能上改变LAG3的状态，最后在体内模型和临床数据中验证其关键作用和转化价值，形成了一个完整的故事链。
五、 研究结论与意义
本研究得出结论：配体结合诱导的、由Cbl家族E3连接酶介导的非降解性泛素化，是激活LAG3免疫检查点功能的关键分子开关。其核心机制是通过泛素链的空间位阻效应，将LAG3的抑制性信号基序从细胞膜的隔离状态中释放出来。
这项研究的科学价值在于： 1. 解决了领域内一个长期存在的根本性问题：首次清晰地揭示了LAG3如何从“待机”状态转变为“激活”抑制状态的分子机制，统一并完善了对其多个胞内基序（EP, BRS, FSALE, KIEELE）功能的理解，提出了一个整合性的LAG3信号模型。 2. 发现了免疫受体调控的新范式：揭示了“泛素化介导的信号基序从膜上解离”这一全新的免疫受体激活机制，这可能是一种具有普遍意义的调控方式。 3. 提供了全新的研究工具和视角：将LAG3泛素化确立为其信号活性的直接分子读数，为未来研究LAG3生物学和药物作用机制提供了关键工具。
其应用价值在于： 1. 指导药物开发：LAG3泛素化检测可用于高通量筛选和评估新型LAG3靶向治疗药物（无论是拮抗剂还是激动剂）的效力。 2. 精准医疗：提出的“LAG3+Cbl共表达”生物标志物，有望在未来临床试验中用于识别最可能从LAG3阻断疗法中获益的患者，实现个性化治疗，提高治疗响应率。 3. 指导联合治疗：加深了对LAG3在肿瘤微环境中功能的理解，为设计更合理的联合免疫治疗方案（如与PD-1联用）提供了理论基础。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究还指出了当前工作的局限性，例如用于验证生物标志物的临床队列样本量有限且仅限于黑色素瘤，需要在更大型、更多癌种的临床试验中进行进一步验证。这为后续研究指明了方向。此外，作者在讨论部分提出了一个整合的LAG3信号模型：在无配体时，LAG3通过暴露的EP基序发挥基础（ tonic）抑制功能；配体结合后，通过Cbl介导的KIEELE基序泛素化，释放出膜结合的FSALE基序，从而增强抑制信号。这一模型系统性地解释了先前看似矛盾的发现，为领域提供了清晰的理论框架。