这是一项关于一种泛汉坦病毒（pan-hantavirus）保护性抗体结构和作用机制的研究。该研究由来自美国、法国、瑞典、芬兰和德国等多个研究机构的科学家合作完成。主要研究者包括 Eva Mittler、Alexandra Serris、Emma S. Esterman、Catalina Florez、Felix A. Rey、Andrew S. Herbert、Laura M. Walker、Kartik Chandran 和 Pablo Guardado-Calvo 等。他们分别隶属于 Albert Einstein College of Medicine、Institut Pasteur、Adimab LLC、U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID)、Umeå University 和 University of Helsinki 等机构。该研究成果于 2023 年 6 月 14 日发表在 Science Translational Medicine 期刊上，论文标题为《Structural and mechanistic basis of neutralization by a pan-hantavirus protective antibody》。
汉坦病毒（hantavirus）是一类由啮齿动物传播的负链 RNA 病毒，可导致两种严重的人类疾病：旧世界汉坦病毒引起的肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）和新世界汉坦病毒引起的汉坦病毒心肺综合征（hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS）。目前尚无获批的疫苗或特效治疗药物。汉坦病毒表面糖蛋白复合物 Gn/Gc 介导病毒进入细胞，是中和抗体（neutralizing antibodies, nAbs）的主要靶标。此前，研究团队从一名曾感染普马拉病毒（Puumala virus, PUUV）的供体中分离出一株罕见的人源单克隆抗体 ADI-42898，该抗体具有跨进化枝的广谱中和活性，但其分子机制尚不明确。本研究旨在解析 ADI-42898 与 Gn/Gc 复合物的结构基础，阐明其中和机制，并通过抗体工程优化其对新世界汉坦病毒（尤其是安第斯病毒，Andes virus, ANDV）的效力。
研究团队首先通过 X 射线晶体学解析了 ADI-42898 的单链可变区片段（scFv）与 PUUV GnH/Gc 复合物的晶体结构。结果显示，ADI-42898 同时结合 Gn 和 Gc 两个亚基，识别一个由 Gn 帽环（capping loop）、Gc 结构域 II 的 bc 环和 cd 环组成的四级表位（quaternary epitope），埋藏表面积约 745 Ų，其中 Gn 和 Gc 各占约 40% 和 60%。抗体互补决定区（complementarity-determining regions, CDRs）中的关键残基包括重链 CDR-H3 的 R98 和 Y99、轻链 CDR-L1 的 Y30 以及 CDR-L2 的 Y53。丙氨酸扫描突变实验表明，Y99H3 的替换使抗体完全失去结合活性，而 Y30L1 的替换使结合力下降约 70 至 90 倍。此外，通过回复种系（germline）序列的抗体变体分析，发现轻链框架区 2 中的体细胞高频突变（somatic hypermutation, SHM）Y49S 对维持 CDR-H3 的有利构象至关重要。
为鉴定表位中的关键病毒残基，研究团队利用携带八种不同汉坦病毒 Gn/Gc 的重组水疱性口炎病毒（recombinant vesicular stomatitis virus, rVSV）进行中和实验，发现残基 98Gn 的侧链是决定抗体敏感性的关键因素。进一步的逃逸突变体筛选显示，在 ANDV 和辛诺柏病毒（Sin Nombre virus, SNV）的 Gn 帽环中出现的突变（A96T、S88N、T90N）均引入了 N-糖基化位点（sequon），通过空间位阻掩盖表位。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析证实了突变体在 N94Gn 处获得了近完全的 N-糖基化修饰。值得注意的是，在已知汉坦病毒株中从未观察到帽环序列中存在 N-糖基化位点，这提示此类逃逸突变在真实病毒中可能因不适合病毒粒子出芽而被自然淘汰。
机制研究表明，ADI-42898 通过将 Gn/Gc 复合物锁定在融合前构象来阻断病毒膜融合。在融合-感染（fusion-infection）实验中，ADI-42898 以剂量依赖方式抑制由 PUUV 和 ANDV Gn/Gc 介导的膜融合。虽然该抗体能阻断可溶性受体 protocadherin-1 (PCDH1) 对 rVSV-ANDV-Gn/Gc 的捕获，但并不能阻止病毒粒子附着到内皮细胞表面，说明抑制受体结合并非其中和活性的主要机制。单价 Fab 片段的中和活性远低于双价 IgG，且对 ANDV 的活性损失更为显著，表明双价结合和相邻四聚体之间的交联（cross-linking）对其中和活性至关重要。结构建模提示，ADI-42898 无法在同一四聚体内实现双价结合，而必须交联病毒粒子表面晶格中相邻的 Gn/Gc 四聚体。
关键发现之一是，ADI-42898 与 ANDV Gn/Gc 形成的免疫复合物在内体酸性 pH（pH 5.5）下的稳定性远低于与 PUUV 的复合物。生物膜干涉（biolayer interferometry, BLI）实验显示，ANDV GnH/Gc 与抗体复合物在 pH 5.5 下的半衰期（t₁/₂）为 519 秒，而 PUUV 对应复合物的半衰期为 1083 秒。这一酸性 pH 下加速解离的特性解释了 ADI-42898 对 ANDV 中和效力较低的原因：在内体酸化后，较大比例的抗体分子从 ANDV 病毒粒子上脱落，使得更多 Gn/Gc 刺突得以发生融合所需的构象变化。
为克服这一限制，研究团队通过体外亲和力成熟（affinity maturation）技术对 ADI-42898 进行工程改造。他们筛选了 1020 个携带单点 CDR 突变的 Fab 克隆，并进一步组合优化，最终获得两个先导变体 ADI-65533 和 ADI-65534。这两个变体均携带 G100aH3V 和 C32L1V 两个共同突变，ADI-65534 还额外含有 T28E 突变。在 pH 5.5 条件下，两个变体与 ANDV GnH/Gc 的解离速率均比母抗体降低约 10 倍。在病毒粒子水平的实验中，ADI-65534 在酸性 pH 下从 ANDV 病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）上的释放显著减少，并且在阻断 ANDV Gn/Gc 介导的融合-感染方面表现最优（IC₅₀ 为 2.3 nM，而母抗体为 15.4 nM）。这些结果证实，提高免疫复合物在酸性 pH 下的稳定性是增强抗体效力的有效策略。
在叙利亚仓鼠（Syrian hamster）致死性 ANDV 攻毒模型中，ADI-65534 展现出显著的保护效力。在 0.5 mg/kg 的低剂量下，ADI-42898 仅提供 50% 保护，而 ADI-65534 提供约 85% 保护。更为重要的是，研究团队首次在该模型中测试了病毒感染后晚期给药的保护效果。他们通过纵向研究确定，ANDV 感染后第 5 天可在肺组织中检测到病毒，第 6 天在血清中检测到，第 8 天达到峰值。在攻毒后第 6 天或第 7 天给予单剂 25 mg/kg 的 ADI-65534，均能保护超过 80% 的动物免于死亡，而所有对照组动物均死亡。这一结果将治疗窗口显著延长至病毒复制接近峰值的阶段，比此前几乎所有研究（通常在攻毒后 3 天内给药）更为严格。此外，在 PUUV 的堤岸田鼠（bank vole）模型中，ADI-65534 与母抗体具有同等的暴露前保护效力，表明亲和力成熟未损害其广谱活性。
本研究的科学价值在于首次从原子水平揭示了靶向汉坦病毒 Gn/Gc 四级表位的广谱中和抗体的识别机制，并阐明了内体酸性 pH 下免疫复合物稳定性对抗体效力的决定性作用。这一原理不仅适用于其他靶向 II 类融合糖蛋白的抗体，还可能推广至更广泛的内体融合阻断型中和抗体。在应用价值方面，ADI-65534 作为候选的泛汉坦病毒治疗抗体，在严格的暴露后治疗模型中展现出显著保护效果，为 HFRS 和 HCPS 的预防和治疗提供了极具前景的候选药物。此外，该研究还提示，通过结构导向的免疫原设计来稳定 Gn/Gc 融合前构象并遮蔽非界面表位，可能有助于诱导此类罕见但广谱的抗体应答，为通用汉坦病毒疫苗的研发提供了重要思路。