NDUFAF6在复杂I组装和线粒体疾病中的作用

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系统分析NDUFAF6在复杂I组装和线粒体疾病中的作用

背景介绍

线粒体复合I（complex I，CI）是呼吸链中的一个至关重要的组件，它在氧化磷酸化（oxphos）过程中的作用是将电子引入线粒体呼吸链，并与复合II-IV一起生成并维持驱动ATP合成的质子动力势。研究表明，单独的CI缺陷构成了主要线粒体疾病的最常见原因之一，影响约每5000人中的1个。约一半的CI缺陷被认为是由影响CI组装因子（CI assembly factors, CIAFs）的致病变异所引起的，这些因子并不是CI全酶的一部分。虽然这些CIAFs在CI疾病发病机制中的作用显著，但它们的确切分子功能尚未明确，这不仅使得研究它们的机理变得复杂，也使得潜在致病基因变异的解释和诊断变得困难。

来源介绍

本研究发表在《Nature Metabolism》期刊上，标题为“Systematic analysis of NDUFAF6 in Complex I Assembly and Mitochondrial Disease”，doi为https://doi.org/10.1038/s42255-024-01039-2。该论文的作者包括Andrew Y. Sung、Rachel M. Guerra、Laura H. Steenberge等，他们分别来自于美国威斯康星大学医学院、圣路易斯华盛顿大学医学院、英国纽卡斯尔大学医学科学部、德国慕尼黑技术大学人类遗传学研究所等多家著名研究机构，研究时间始于2023年9月6日，于2024年3月28日被接受发表。

研究流程和方法介绍

深度突变扫描的工作流

研究团队设计了一种深度突变扫描（DMS）方法，系统地评估了成千上万种NDUFAF6基因变异的功能。他们利用了以下实验步骤：

  1. 创建NDUFAF6基因敲除的HEK293T细胞系： 研究人员首先使用CRISPR-Cas9技术创建了两个独立的af6基因敲除（KO）细胞系，并通过Sanger测序、西方印迹和凝胶内CI活性测定验证这些KO细胞系是否缺乏af6和CI。

  2. 生成并转染突变库： 研究人员合成了覆盖NDUFAF6所有可能突变的突变库，并将其克隆至慢病毒载体中，然后转染至af6 KO细胞系。

  3. 筛选并选择功能性变体： 通过转入含有突变NDUFAF6变体的KO细胞并在以半乳糖为主要碳源的培养基中进行筛选，筛选得到在半乳糖培养基中能够生长的功能性变体。

  4. 深度测序分析： 使用高通量测序技术，分析半乳糖生长选择前后每个变体的读数比，并计算变体的适应性得分。

研究结果显示他们的突变扫描数据的质量通过各种方法得到验证，包括具备很高的测序深度、高度相关的适应性得分以及模拟的突变敏感性与预期结构模型的良好一致性。

蛋白质-蛋白质交互分析

研究团队结合深度突变扫描数据和AlphaFold预测的af6模型，展开一系列实验探讨af6的分子功能。他们采用交联质谱技术识别出af6可能的结合伙伴，发现af6特异性地与核心CI亚基NDUFS8结合。进而，通过酵母双杂交实验验证af6表面突变是否影响其与NDUFS8的相互作用，结果表明af6与NDUFS8的特异性结合由特定的表面位点调控。

阵蓝原位电泳实验和西方印迹

为了确定af6在CI组装中的中介作用，研究者通过蓝原位电泳跟踪Q模块亚基和组装因子在HAP1野生型和CIAF敲除细胞系中的迁移模式，发现af6确实通过促进NDUFS8的组装在过渡到125 kDa中间产物中起关键作用。

主要结果

af6功能鉴定和NDUFS8的整合

深度突变扫描数据在结合结构预测的基础上，揭示了af6确实是一个假酶，直接与CI亚基NDUFS8结合，并指导其整合到125 kDa组装中间产物中。进一步的实验表明，通过过表达NDUFS8可以挽救af6缺失引起的缺陷，展示了这种特异性相互作用的潜在治疗途径。

突变敏感性的功能区域

深度突变扫描数据还突出显示了一些突变敏感性高的蛋白区域，提示这些区域具有功能相关性。例如，af6的C末端螺旋结构在其膜关联性中起重要作用，并且这种膜关联性对于CI组装是必不可少的。

新病理变异的具象化

此研究通过实验支持了七种新的与人类病理学相关的af6变异的致病性，并为超过5000种未注释af6变异提供了功能证据，创建了一个临床资源库以支持af6相关疾病的诊断。

结论和意义

研究的新发现不仅填补了关于af6在CI组装中的分子角色的知识空白，还为功能变异和疾病病因提供了新的诊断资源。在此基础上，本研究还提出通过调节现有的NDUFS8水平来直接补偿af6功能失常的潜在治疗途径。此外，深度突变扫描数据还改进了ACMG（美国医学遗传学和基因组学学会）框架下的变异解释，提高了几个已存在变异的分类，并确立了七种新致病变异。

研究亮点

  1. 鉴定af6作为假酶的功能： 本研究确认af6通过蛋白-蛋白相互作用来介导CI的组装，而不是通过酶活性。
  2. 新方法和技术的应用： 深度突变扫描的系统方法为研究未定义功能的线粒体蛋白提供了一种新的工具。
  3. 临床应用价值： 提供了广泛的功能性变异数据，支持临床上对af6相关疾病更准确的诊断和新的治疗策略开发。

本研究的成功展示了深入理解线粒体蛋白质组装因子功能的重要性，并为研究其他尚未明确功能的线粒体蛋白提供了有价值的实验框架和方法学启示。