一种用于多重缺失筛选的高效基准化基因编辑平台
高效齐全的基因组编辑工具:多重敲除筛选的高效校准Prime Editing平台
在基因组编辑领域,Prime Editing技术因其精确性和灵活性受到高度关注。这种方法无需双链断裂(DSBs),可直接在基因组中实现精准的单碱基替换和小型插入或缺失修改。然而,在大规模功能基因组学研究中,Prime Editing的应用面临效率低且不稳定的问题。为应对这一挑战,一项由Princeton University和University of California San Diego等多个研究机构的科研团队合作开展的研究,通过开发一个具有高编辑效率的Prime Editing平台,为解决多重敲除筛选问题带来了突破性进展。这篇题为“A benchmarked, high-efficiency prime editing platform for multiplexed dropout screening”的研究论文发表在2025年1月的《Nature Methods》上。
研究背景和动机
随着人类基因组测序技术的进步,大规模遗传变异数据库的建立为人类疾病与表型之间的关联研究提供了重要基础。然而,要实现这些关联的功能验证,现有的基因编辑技术面临重大挑战。例如,传统利用Cas9的同源定向修复方法(homology-directed repair, HDR)因效率低、编辑精确性差,难以实现高通量功能筛选。另外,近年发展出的碱基编辑(Base Editing),尽管能高效编辑特定位点,但受限于编辑类型(例如C>T或G>A转变)并常伴随旁观者突变(bystander mutations)的产生。针对这些问题,Prime Editing技术被认为能够克服这些不足,其兼容性与潜力备受瞩目。然而,实验效率仍然是其广泛应用的瓶颈。
此次研究旨在评估Prime Editing技术在高通量功能筛选中的潜力,并为此设计了可操作性更高的编辑平台,以实现从编辑到筛选更通用的流程。此改进平台具有精准的“多重敲除”能力,可用于揭示基因突变的功能,为深入理解人类遗传变异提供了重要工具。
研究团队和论文来源
本文由来自Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics和Department of Molecular Biology, Princeton University的Britt Adamson教授领导的团队完成,合作作者还包括来自California San Diego等研究机构的学者。论文发表于2025年1月的《Nature Methods》期刊。
研究流程和设计
研究围绕改进的Prime Editing平台展开,采用了多个步骤与实验方法,以全面测试多重敲除筛选效率。研究具体流程和主要方法包括:
1. 构建增强型Prime Editing系统
团队开发了两种稳定表达Prime编辑酶蛋白的K562细胞株:PE2和PEmax。PEmax细胞株由于整合了优化的逆转录酶(reverse transcriptase, RT)和Cas9突变体,具有更高的编辑效率。此外,为提高编辑精准性,研究还在DNA错配修复(mismatch repair, MMR)缺失的背景下构建了一个额外的PEmax衍生细胞株PEmaxKO用于研究。
通过长期培养并对两种修饰型细胞进行定量荧光分析,研究发现PEmax在1个月内的编辑效率显著高于PE2,精准的编辑产物比例大幅提升,错误结果比例保持低水平。
2. 开发专用guide RNA库并优化epegRNA设计
研究设计并测试了一种创新的工程化prime editing guide RNA(epegRNA),结合TEVopreq1结构增强稳定性。同时,开发了2种自靶向的感应器库(sensor library): - +5 G>H突变研究库:筛选了640个目标位点,引入三种同一+5位点上的不同突变(G>A, G>T, G>C),分析不同设计对编辑效率的影响。 - 全范围编辑检测库:针对小鼠ZRS增强子,设计并评估多种位点、多变体的单碱基替换。
通过深度测序和数学模型预测,团队发现RNA模板(RTT)长度、PBS长度及突变位置均对编辑效率影响显著,尤其是与原核酶切片距相差±5的区域编辑效率更高。
3. 大规模敲除筛选与数据分析
随后,研究进一步应用上述优化平台,设计了规模约为24万条epegrna的多重敲除筛选文库“stoppr”。此文库共包含: - 13万个epegrna,诱导129,696个无义(nonsense)突变。 - 9万个匹配的“同义突变”对照。 - 额外“无编辑”与“非靶向”对照,校准实验背景。
将stoppr库特异性靶向K562细胞系,实验表明,即使在大规模筛选下,PEmaxKO条件仍能高效诱导表型相关的重要突变,特别是对一些基本基因的停用效应产生了显著表型(如细胞生长抑制)。
4. 数据验证与高通量应⽤
通过个别验证策略,实验重现了10个无义突变的表型,并通过靶向深测支持了这些表型归因于目标编辑,而非二次效应。此外,配对的同义突变对照实验进一步验证了体系的特异性。
实验结果和发现
研究获得了以下重要成果: 1. 高效精准的编辑效率:特定编辑(如+5位点无意义突变)成功率高达81%,而编辑精确率最高达95%。 2. 表型特异性验证:无义突变诱导的细胞增长抑制表型在89.3%的目标基因内观测到,与对照相比具有较高特异性。 3. 设计原则总结:长RTT、靶点在基因内靠前区域、anti-sense方向的设计整体效果优异。
研究意义与价值
此次研究意义非凡。通过优化Prime Editing平台,团队显著提高了编辑效率,展现了此技术在功能基因组学领域的应用前景。实验解决了Prime Editing原有效率不理想的关键问题,并提供了高效epegRNA设计的指导原则。此外,探测基因无意义突变的能力为功能基因注释和疾病致病基因的筛选研究提供了重要工具。
研究亮点
- 技术先进性:研究首次针对Prime Editing开发出大规模适配的简单筛选流程平台,无需额外基因组测序。
- 应用广泛性:定量评估了数万个遗传变异,直接为个性化治疗的基因功能筛选铺平道路。
- 方法创新性:通过MMR缺失背景优化Prime Editing效率,结合高通量感应库检测大大降低数据成本。
通过本研究,Prime Editing作为功能基因组学中的革命性工具迈出了重要一步。未来,进一步优化筛选体系,并针对复杂基因组背景调整方法,或将实现人工智能加持的设计模式,从而推动疾病诊断与基因治疗的精准化发展。