基于物理组织特性的准空间单细胞转录组揭示肝脏早期衰老相关微环境

2025-06-28 Sat
重新定义肝脏早期衰老微环境：Quasi-spatial单细胞转录组揭示纤维化壁龛的形成与细胞异质性背景及研究动因衰老是生命过程中不可避免的一环，其最显著的特征之一便是器官组织中衰老细胞（senescent cells）的积累。这些细胞常由组织损伤诱发，且随着机体免疫监视能力衰退，愈发难以被及时清除。衰老细胞的存在及其所分泌的炎症相关分子（即衰老相关分泌表型，SASP）对组织微环境具有复杂影响，既可能参与生理性修复，也可能诱发慢性炎症，损害组织稳态。然而，当前科技手段在解析这些细胞在组织内的具体分布、表型多样性乃至其对微环境的影响上，仍面临诸多难题。尤其在肝脏这类容易伴发纤维化的重要器官上，衰老细胞相关壁龛的形态、动态发展规律以及各类细胞间复杂的空间互作关系，尚不清晰。
近年来，单细胞组学技术持续推进，使我们能够从细胞层面对复杂组织进行分层剖析。然而，主流单细胞和空间组学方法由于技术瓶颈及细胞类型丰度差异，往往遗漏了纤维化壁龛的细胞组成——这类细胞通常在标准解离工艺中因ECM（细胞外基质）丰富而难以获得。因此，探索一种能够富集、定位并多组学描摹衰老相关纤维化壁龛新方法，成为揭示肝脏衰老机制、开发抗衰对策的科学难题。
论文来源及作者背景本文发表于国际权威期刊Nature Aging，卷5，期号为2025年5月刊，页码929-949。论文的主要作者包括kwon yong tak, juyeon kim, myungsun park，wooseok kim，seoyeong lee等人，来自韩国KAIST、KRIBB及多家研究机构。通讯作者为kimchuna@kribb.re.kr及jp24@kaist.ac.kr。这些单位在生物医学领域具有雄厚的基础与创新能力。
研究设计与创新方法（a）研究对象与分组设定本研究围绕自然衰老小鼠肝脏纤维化壁龛展开，采用了5-6月龄（青年组）与22-24月龄（老年组）雄性小鼠作为模型对象。为揭示不同年龄肝组织细胞微环境间的异同，作者分别设置了常规控制组与fibrotic niche enrichment sequencing（fini-seq）壁龛富集组，各分设青年和老年亚组。样本总数达18份，青年/老年组分别纳入3-4只/5-6只小鼠。
工艺流程与技术创新壁龛富集流程创新

研究团队首先采用Sirius-red特殊染色和胶原蛋白免疫荧光，对小鼠肝脏切片纤维化区域进行组织学定位，确认衰老随年龄增长，肝脏周大血管区发生明显ECM富集及胶原沉积。

为针对性实现壁龛细胞富集，团队根据高ECM区域难以酶消化的物理属性，建立“双次消化”分离流程。第一次常规解离后留存的未完全消化组织块，经再次酶消化、体外培养等处理，发现其产物细胞形态多样、可扩增能力强且体外分泌更多、更致密的ECM。进一步的原子力显微镜测定显示该部分ECM硬度更大，蛋白组学定量也证实其高表达多类ECM蛋白及促炎趋化因子CXCL12。

该技术流程被命名为fibrotic niche enrichment sequencing（fini-seq），为后续单细胞RNA测序（scRNA-seq）及单核ATAC测序（snATAC-seq）带来了关键富集前提。
单细胞/单核组学与数据分析

fini-seq分离获得的细胞样本，分别进行scRNA-seq和snATAC-seq，辅以传统一次性解离获得的对照组，用以量化壁龛相关稀有细胞富集效应。共检测84,351个细胞（RNA）及22,377个细胞核（ATAC）。

数据分析采用harmony进行批次校正、leiden聚类和已知系谱marker标注。为排查组织解离诱导的批次效应和数据偏差，团队利用非负矩阵分解（NMF）算法辨识并筛除高解离偏倚基因。空间分析方面，联合RNA原位杂交（RNAscope）、空间转录组（Visium及Stereo-seq）、免疫荧光/流式细胞术等多轮手段，实现了多维度、全空间的系统性分析。
新颖性与专有技术
基于物理属性的壁龛细胞富集，有效克服传统单细胞组学手段难以富集ECM丰富壁龛内细胞的瓶颈。
fini-seq 联合多组学，系统性揭示了从表型、转录组到表观遗传的微环境异质性变化。
空间组学+原位杂交，精准描摹壁龛细胞在肝脏具体解剖部位（门静脉区）上的分布格局。
研究主要发现与结果详述（b）1. 衰老导致肝脏纤维化壁龛特有细胞谱系重塑壁龛富集组比对照组更好地代表了年龄相关的壁龛微环境，尤其在老年小鼠肝脏中观察到纤维化细胞、内皮细胞（EC）、免疫细胞等明显富集。fini-seq样本ECMs生成能力更强，表现为更密实的基质与更高刚度，蛋白组学显示collagen XIV（Col14a1）显著升高，而其他常见胶原如Col1、Col3表达变化不显著。
2. 发现高度异质性的衰老相关细胞亚群内皮细胞（Endothelial cells，EC）

在fini-seq富集的老年壁龛区域，传统肝特异性LSEC（肝窦状内皮细胞）大幅减少，而表现为“纤维化内皮细胞（fibrotic ECs）”的亚群大量涌现，这些EC丧失肝脏区域型转录特征，更接近小肠/心肌等器官的EC谱系。功能上，这类EC趋化、炎症及衰老相关基因（如CXCL10、IL6、CDKN1A、CDKN2A）高表达，内吞与清除能力下降，推测加剧肝组织慢性炎症与病理重塑。

四种fibrotic EC亚型中，Sema3g高表达的“ec_sema3g”占比超过半数，表现出Notch、P53、MAPK等通路活性及典型“衰老”分子特征。空间原位杂交证实其特异聚集于肝门静脉周围，年龄增长时与CDKN1A共标记的比例升高。
血管平滑肌细胞（vSMCs）

富集出以高IL6表达为特征的vSMC_il6high细胞，数量在老年壁龛增至2.2倍。这类细胞不仅炎症、p53、免疫调控及血管生成相关通路上调，也表现出明显的衰老相关基因集（SenMayo+）活性。
成纤维细胞（Fibroblast）与肝星状细胞（HSCs）

细致分型揭示了多亚型成纤维细胞。尤其是fb_wif1与fb_smoc1两类免疫互作型成纤维细胞，在壁龛区域高丰度富集。fb_smoc1既参与ECM合成、PI3K/AKT活性，也与衰老密切相关。空间染色证实其与fibrotic ECs共定位于门静脉区域。
3. 免疫环境重构——T细胞募集及枯竭壁龛区80%为免疫细胞，T细胞占比过半。进一步亚型分析表明，随着衰老推进，CD8+组织驻留记忆T细胞（CD8+ TRM）中特别是PD-1^high的枯竭亚群大幅增加。细胞互作分析及流式细胞术均证实了富集区对T细胞的高吸附与枯竭倾向，推测与fibrotic EC高表达PD-L1导致免疫耐受、衰老细胞逃逸清除直接相关。
4. 表观遗传机制及空间异质性fini-ATAC-seq发现fibrotic EC的开放染色质区域高度富集NF-κB, HIF1a等关键调控因子位点，这揭示低氧应激和慢性炎症信号可能是驱动壁龛形成及细胞重编程的关键因素。fibrotic EC同样获得了OSKM（Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc）相关重编程特性。空间组学分析揭示壁龛细胞呈斑块状、马赛克式分布于门静脉周围，且不同壁龛细胞间空间异质性明显——fb_wif1主导早期急性应答，fb_smoc1主导慢性重塑。
研究结论及学术应用价值（c-d）本研究首次提出并实践了基于物理属性壁龛细胞富集+多组学联合解析的fini-seq技术路线，系统性揭示了肝脏早期衰老微环境的动态演化、多细胞谱系重塑及分子驱动力。主要结论及其意义如下：
首次描绘自然衰老背景下肝脏纤维化壁龛全景与空间分布，为理解整体肝衰老进程、精准干预提供了理论基础。
揭示fibrotic EC、fb_smoc1等新型细胞亚型，弥补了常规技术忽略这一类“难解离”重要细胞遗漏，实现稀有细胞群体功能挖掘。
明确低氧、慢性炎症、细胞互作（如PD-L1/PD-1轴）等驱动壁龛形成的新机制，为抗衰老、抗纤维化治疗靶点提供科学依据。
提出并验证免疫互作型成纤维细胞的多阶段功能分工模型，细化免疫募集、基质重塑在壁龛进程乃至疾病发生中的时间窗口与作用情景。
空间组学创新性揭示壁龛结构呈异质性斑块分布，为认识组织病变起源、波及与演进路径提供了新思路。
fini-seq作为技术平台，具备通用推广应用于其他器官、疾病（如早期纤维化、肝硬化、实体瘤等）的潜力。
研究局限及后续展望作者也指出，fini-seq在某些类型（如肝细胞）的检测灵敏性和定量准确性仍有限，尤其是大体积、高易损类型细胞（如肝细胞）在双次消化过程中有损失风险。未来或可联合单核RNA-seq等补充方案。同时，物理富集针对的“难消化”性质可能还受到解剖区结构刚度的干扰，需更精细的生物物理参数核查。
总结本研究以fini-seq技术为牵引，以多组学、多手段、空间整合视角，建立了肝脏衰老壁龛全细胞、全空间的研究范式。其不仅突破了传统单细胞组学瓶颈，还解锁了早期病变微环境与免疫调控间的复杂博弈关系。未来，相关技术有望为肝脏等器官衰老机制、早期预警和靶向干预提供系统性解决思路，为衰老研究与转化医学带来新突破。