ヒトプロヒビチン複合体のin situ構造

2025-04-29 Tue
プロヒビチン複合体ミトコンドリア内膜構造生物学クライオ電子断層撮影分子モデリング
学術的背景ミトコンドリアは細胞のエネルギー工場であり、その内膜（mitochondrial inner membrane, MIM）の完全性は細胞機能にとって極めて重要です。prohibitin（PHB）は高度に保存されたタンパク質ファミリーであり、PHB1とPHB2の2つのサブタイプを含み、ミトコンドリアストレスシグナリング、細胞周期制御、アポトーシス、寿命調節など、さまざまな細胞プロセスで重要な役割を果たしています。PHB1とPHB2はミトコンドリア内膜で足場タンパク質として機能すると考えられていますが、その分子組織は長い間不明でした。過去の研究では、酵母でのネガティブ染色電子顕微鏡（EM）を用いて、PHB1/PHB2ヘテロ二量体が直径約20 nmの環状構造を形成する可能性が示唆されていましたが、これらは直接的な実験的証拠を欠いていました。したがって、ヒトprohibitin複合体の分子構造を明らかにすることは、ミトコンドリア内膜の完全性と空間組織におけるその機能を理解する上で重要な意義を持ちます。
論文の出典本研究は、Max Planck Institute for Multidisciplinary Sciences、University Medical Center Göttingen、Altos Labsなどの研究チームによって行われ、主な著者にはFelix Lange、Michael Ratz、Jan-Niklas Dohrkeなどが含まれます。論文は2025年4月に『Nature Cell Biology』誌に掲載され、タイトルは「In situ architecture of the human prohibitin complex」です。
研究の流れ1. タンパク質の局在と発現制御研究ではまず、CRISPR-Cas9遺伝子編集技術を用いて、ヒトU2OS細胞において内因性発現するPHB1とPHB2の蛍光標識細胞株（PHB1-DKとPHB2-DK）を生成しました。蛍光顕微鏡と免疫金標識電子顕微鏡（immunogold EM）を用いて、PHB1とPHB2が主にミトコンドリアのクリスタ膜（crista membrane, CM）に局在し、その濃度は内膜境界膜（inner boundary membrane, IBM）よりも3-5倍高いことが明らかになりました。さらに、蛍光回復実験（FRAP）により、PHB1とPHB2がクリスタ膜上で低い流動性を示すことが確認され、クリスタ膜における安定した局在が支持されました。
2. 定量分析と複合体の存在量推定定量ウェスタンブロット法により、各U2OS細胞中のPHB1とPHB2の分子数はそれぞれ約3.38 × 10^6および3.46 × 10^6であることが確定しました。これらのデータに基づき、各U2OS細胞には約2.14 × 10^5個のprohibitin環状複合体が存在し、そのうち約1.7 × 10^5個がクリスタ膜上に存在すると推定されました。さらに、各クリスタ膜には平均して約15個のprohibitin環状複合体が分布し、クリスタ膜表面積の0.7-1.4%を占めることが計算されました。
3. クライオ電子トモグラフィー（cryo-ET）とサブトモグラム平均prohibitin複合体の構造を直接観察するため、研究チームはクライオ電子トモグラフィー（cryo-ET）を用いてU2OS細胞を撮影しました。焦点イオンビーム（FIB）技術を用いて約150 nmの厚さのクライオセクションを調製し、Titan Krios G2顕微鏡でデータを収集しました。クリスタ膜上には直径約20 nmの多数の凸状構造が観察され、これらの構造は側面図では凸形で、高さは約9 nmでした。サブトモグラム平均（subtomogram averaging）技術を用いて、prohibitin複合体の三次元構造が得られ、分解能は16.3 Åに達しました。この構造は、prohibitin複合体が鐘形で、11個の交互に並んだPHB1とPHB2分子から構成されていることを示しています。
4. 分子モデリングと動的シミュレーションAlphaFold2で予測されたPHB1とPHB2の構造に基づき、研究チームは11個の単量体分子をクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）密度マップに手動でフィットさせ、prohibitin複合体の分子モデルを構築しました。このモデルは、PHB1とPHB2がN末端の膜貫通ドメインを介して脂質二重層に埋め込まれ、C末端のコイルドコイルドメインが電荷相互作用によって複合体の上部を安定化していることを示しています。さらに、分子動力学（MD）シミュレーションにより、このモデルの安定性が検証され、N末端ドメインが高い動的性を示す一方、C末端ドメインがより安定していることが明らかになりました。
5. クロスリンク質量分析（XL-MS）による検証分子モデルをさらに検証するため、研究チームはマウスとヒトのクロスリンク質量分析（XL-MS）データを分析しました。その結果、ほとんどのクロスリンクペプチドペアがモデル中のCα-Cα距離が30 Å未満であり、C末端コイルドコイルドメインの相互作用が支持されました。さらに、自己クロスリンクペプチド（self-links）はPHB1-PHB1またはPHB2-PHB2界面でのみ距離制約を満たし、11個の交互に並んだPHB1とPHB2分子からなる複合体構造がさらに支持されました。
研究結果prohibitin複合体の鐘形構造：研究は初めてヒトprohibitin複合体の鐘形構造を明らかにし、この構造が11個の交互に並んだPHB1とPHB2分子からなり、ミトコンドリア内膜に埋め込まれていることを示しました。
複合体の存在量と分布：各U2OS細胞には約2.14 × 10^5個のprohibitin複合体が存在し、そのうち約1.7 × 10^5個がクリスタ膜上にあり、各クリスタ膜には平均して約15個の複合体が分布しています。
分子モデルの安定性：分子動力学シミュレーションとクロスリンク質量分析データにより、prohibitin複合体モデルの安定性と正確性が検証されました。
研究の意義科学的価値：本研究は初めて原子レベルでヒトprohibitin複合体の構造を明らかにし、ミトコンドリア内膜の完全性と空間組織におけるその機能を理解するための構造的基盤を提供しました。
応用価値：prohibitin複合体の構造情報は、神経変性疾患やがんなどのミトコンドリア機能障害関連疾患の治療戦略の新たなターゲットを提供する可能性があります。
技術的ブレークスルー：研究はクライオ電子トモグラフィー、サブトモグラム平均、分子動力学シミュレーション、クロスリンク質量分析など、複数の先進技術を組み合わせ、構造生物学研究における学際的アプローチの強力な利点を示しました。
研究のハイライトin situ構造解析：研究は初めてin situ条件下でヒトprohibitin複合体の構造を解析し、体外精製による構造の歪みを回避しました。
多技術の統合：研究はクライオ電子顕微鏡、分子モデリング、クロスリンク質量分析など、複数の技術を成功裏に統合し、複雑なタンパク質複合体の構造解析の新しい研究パラダイムを提供しました。
種間保存性：研究はマウスとヒトのクロスリンク質量分析データを比較することで、prohibitin複合体の種間での構造保存性を明らかにし、その機能の重要性をさらに検証しました。
その他の価値ある情報研究はまた、ミトコンドリアクリスタ膜構造に関する詳細なデータを提供し、クリスタ膜の平均長さ、間隔、面積などを含み、これらは将来のミトコンドリア構造と機能の関係を研究する上で重要な参考資料となります。さらに、研究で使用された高分解能クライオ電子顕微鏡技術と分子動力学シミュレーション手法は、他のタンパク質複合体の構造解析において技術的参考となります。