デノボルシフェラーゼによる多重生物発光イメージング

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デノボルシフェラーゼ 多重イメージング 生物発光 タンパク質設計 AI設計

AIによる新規設計ルシフェラーゼが多重生物発光イメージングを実現

学術的背景

生物発光技術（bioluminescence）は、外部光源を必要とせず、生体内でリアルタイムかつ高感度・非侵襲的なイメージングを可能にする技術です。ルシフェラーゼ（luciferase）は発光反応を触媒する鍵酵素ですが、天然のルシフェラーゼは、タンパク質の折り畳み不良、巨大な分子サイズ、ATP依存性、低い触媒効率など多くの限界を抱えています。これらの制約は、生物医学研究における生物発光技術の広範な応用を妨げてきました。近年、定向進化（directed evolution）などの方法で天然ルシフェラーゼを改良する試みも進められていますが、これらの限界を完全には克服できていません。

この課題を解決するため、研究チームは深層学習ベースのタンパク質設計手法を用い、de novo設計（from scratch）による新規ルシフェラーゼNeoLuxシリーズを開発しました。これら人工設計されたルシフェラーゼは、優れた触媒効率・安定性・小型化・ATP非依存性などの特長を持つだけでなく、蛍光タンパク質（fluorescent protein, FP）と結合し、高効率の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）系を形成することができます。これにより、多重生物発光イメージング（multiplexed bioluminescence imaging）が可能となりました。本研究は生物発光技術の応用に新たな展望を拓くものです。

論文出典

本研究はカリフォルニア大学サンタクルーズ校（University of California, Santa Cruz）のJulie Yi-Hsuan Chen、Qing Shi、Xue Pengらによって行われ、責任著者はAndy Hsien-Wei Yehです。論文は2025年3月13日に《Chem》誌に掲載され、タイトルは「De Novo Luciferases Enable Multiplexed Bioluminescence Imaging」です。

研究プロセスと結果

1. 第2世代ルシフェラーゼの計算設計および実験的検証

研究チームはまず、最初の世代であるルシフェラーゼLuxSit-Iの配列空間を深層学習モデルProteinMPNNにより探索し、10,000個の新規アミノ酸配列を設計しました。これらの配列についてAlphaFold2でタンパク質構造を予測し、191個の候補配列を選んで実験的に検証。そのうち134個の配列がルシフェラーゼ活性を示し、設計された配列が元の構造と機能を保持できていることが分かりました。さらに、活性が最も高い20個を選び、大量発現・精製を行った結果、最終的に16個の単量体ルシフェラーゼを得ました。

ルシフェラーゼの活性向上のため、NeoLux1の触媒ポケット上のアミノ酸を組み合わせて変異させ、活性が47%向上したNeoLux1.2を獲得しました。実験の結果、NeoLux1.2は非常に高い熱安定性（Tm > 100°C）を示し、合成基質DTZ（diphenylterazine）に対する高度な特異性を持ちます。さらに、NeoLux1.2のシグナル減衰半減期（decay half-life）は43分と非常に長く、天然ルシフェラーゼよりも高スループットスクリーニング（high-throughput screening）に適しています。

2. ルシフェラーゼ-蛍光タンパク質FRETシステムの設計

多重生物発光イメージングの実現を目指し、研究チームはNeoLux1.2を様々な蛍光タンパク質（mNeonGreen、mGold、mKok、CyOFP1、mKate2）と融合させ、高効率なFRETシステムを設計しました。AlphaFold2によりFRET対の構造を予測し、ルシフェラーゼと蛍光タンパク質間の距離を最適化、エネルギー伝達効率の向上を追求しました。実験により、5種類のFRET対（LuxNeon、LuxGold、LuxKok、LuxOFP、LuxKate）が確認され、そのエネルギー伝達効率は全て90%以上で、かつ蛍光タンパク質本来のスペクトル特性を保持していました。

3. 多重生物発光イメージングへの応用

研究チームは、これらFRETシステムを細胞および生体マウスで多重イメージングに応用できるか検証しました。細胞実験では、線形アンミキシング（linear unmixing）技術により各FRET対のシグナルを判別し、複数の細胞内小器官を同時にイメージングすることに成功。マウス個体実験では、異なるFRET対を発現するHela細胞をマウスに移植し、DTZ基質を静脈注射して多重生物発光イメージングを達成しました。さらに、研究チームはこれらFRETシステムを利用し、腫瘍の異質性（tumor heterogeneity）をリアルタイムでモニタリングすることに成功し、がん研究への応用可能性を示しました。

研究の結論と意義

本研究はAI駆動型のタンパク質設計技術により、新規ルシフェラーゼNeoLuxシリーズを創出しました。これらのルシフェラーゼは、天然型の多くの制約を克服し、蛍光タンパク質と組み合わせ高効率な多重生物発光イメージングを実現できます。研究チームはさらに、細胞および生体モデルでの幅広い応用、例えば複数細胞小器官の同時イメージングや腫瘍異質性のリアルタイム追跡などを実証しました。

本研究は、生物発光技術の新しい応用展開を切り開くものであり、特に癌研究・創薬スクリーニング・生物医用イメージング分野における波及効果が期待されます。さらに、研究チームはオープンな設計配列や実験プロトコルを公開し、コストの大幅削減を可能にしたことで、本技術の普及を大きく促進しました。

研究のハイライト

  1. AI駆動型タンパク質設計：深層学習モデルProteinMPNNとAlphaFold2を用いてde novoで新規ルシフェラーゼを設計し、AIのタンパク質設計における強力な能力を示しました。
  2. 多重生物発光イメージング：高効率なFRETシステムを設計することで、細胞および生体レベルでの多重生物発光イメージングを実現し、複雑な生物学的過程の研究に新たなツールを提供しました。
  3. 高い安定性と特異性：NeoLuxシリーズルシフェラーゼは非常に高い熱安定性および基質特異性をもち、天然型ルシフェラーゼの限界を克服しています。
  4. 低コストかつ広範な応用：研究グループはオープンな設計配列や実験手法を公開し、コストを大幅に下げ、本技術の普及を後押ししました。

その他の有用な情報

研究チームはまた、FRETシステムを用いた腫瘍異質性のリアルタイムモニタリングの有用性を示し、がん研究に新たなツールを提供しました。加えて、低コストな多重生物発光イメージング技術を開発し、生物医学研究への経済的かつ効率的なソリューションを提供しています。

本研究は、生物発光技術の進展を促すだけでなく、AIによるタンパク質設計応用における新たな範例となり、重要な科学的及び応用的価値をもっています。