人类prohibitin复合物的原位结构研究

生物物理学 细胞生物学 生命科学
prohibitin复合物 线粒体内膜 结构生物学 冷冻电子断层扫描 分子建模

学术背景

线粒体是细胞的能量工厂，其内膜（mitochondrial inner membrane, MIM）的完整性对细胞功能至关重要。prohibitin（PHB）是一类高度保守的蛋白质家族，包含PHB1和PHB2两种亚型，它们在多种细胞过程中发挥重要作用，包括线粒体应激信号传导、细胞周期调控、凋亡和寿命调节等。尽管PHB1和PHB2被认为在线粒体内膜中作为支架蛋白发挥作用，但其分子组织方式长期以来一直不明确。以往的研究通过酵母中的负染色电子显微镜（EM）推测PHB1/PHB2异二聚体可能形成直径约20 nm的环状结构，但这些推测缺乏直接的实验证据。因此，揭示人类prohibitin复合物的分子结构对于理解其在维持线粒体内膜完整性和空间组织中的功能具有重要意义。

论文来源

本研究由来自Max Planck Institute for Multidisciplinary Sciences、University Medical Center Göttingen、Altos Labs等机构的研究团队完成，主要作者包括Felix Lange、Michael Ratz、Jan-Niklas Dohrke等。论文于2025年4月发表在《Nature Cell Biology》期刊上，标题为“In situ architecture of the human prohibitin complex”。

研究流程

1. 蛋白质定位与表达调控

研究首先通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，在人类U2OS细胞中生成了内源性表达PHB1和PHB2的荧光标记细胞系（PHB1-DK和PHB2-DK）。通过荧光显微镜和免疫金标记电子显微镜（immunogold EM），研究人员发现PHB1和PHB2主要位于线粒体的嵴膜（crista membrane, CM）上，其浓度比内膜边界膜（inner boundary membrane, IBM）高3-5倍。此外，荧光恢复实验（FRAP）表明，PHB1和PHB2在嵴膜上的流动性较低，进一步支持了其在嵴膜中的稳定定位。

2. 定量分析与复合物丰度估算

通过定量Western blotting，研究人员确定了每个U2OS细胞中PHB1和PHB2的分子数量分别为约3.38 × 10^6和3.46 × 10^6。基于这些数据，研究人员估算出每个U2OS细胞中可能包含约2.14 × 10^5个prohibitin环状复合物，其中约1.7 × 10^5个位于嵴膜上。进一步的计算表明，每个嵴膜上平均分布约15个prohibitin环状复合物，覆盖嵴膜表面积的0.7-1.4%。

3. 冷冻电子断层扫描（cryo-ET）与亚断层图平均

为了直接观察prohibitin复合物的结构，研究人员使用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）对U2OS细胞进行成像。通过聚焦离子束（FIB）技术制备了约150 nm厚的冷冻切片，并在Titan Krios G2显微镜下进行数据采集。研究人员在嵴膜上观察到了大量直径约20 nm的凸起结构，这些结构在侧视图中呈现凸形，高度约9 nm。通过亚断层图平均（subtomogram averaging）技术，研究人员获得了prohibitin复合物的三维结构，分辨率达到16.3 Å。该结构显示prohibitin复合物呈钟形，由11个交替排列的PHB1和PHB2分子组成。

4. 分子建模与动态模拟

基于AlphaFold2预测的PHB1和PHB2结构，研究人员将11个单体分子手动拟合到冷冻电镜（cryo-EM）密度图中，构建了prohibitin复合物的分子模型。该模型显示，PHB1和PHB2通过其N端跨膜结构域嵌入脂质双层，而其C端卷曲螺旋结构域则通过电荷相互作用稳定复合物的顶部。此外，通过分子动力学（MD）模拟，研究人员验证了该模型的稳定性，并发现N端结构域具有较高的动态性，而C端结构域则较为稳定。

5. 交联质谱（XL-MS）验证

为了进一步验证分子模型，研究人员分析了来自小鼠和人类的交联质谱（XL-MS）数据。结果显示，大多数交联肽对在模型中的Cα-Cα距离小于30 Å，支持了C端卷曲螺旋结构域的相互作用。此外，自交联肽（self-links）仅在PHB1-PHB1或PHB2-PHB2界面处满足距离约束，进一步支持了11个交替排列的PHB1和PHB2分子组成的复合物结构。

研究结果

  1. prohibitin复合物的钟形结构：研究首次揭示了人类prohibitin复合物的钟形结构，该结构由11个交替排列的PHB1和PHB2分子组成，嵌入线粒体内膜中。
  2. 复合物的丰度与分布：每个U2OS细胞中约有2.14 × 10^5个prohibitin复合物，其中约1.7 × 10^5个位于嵴膜上，每个嵴膜上平均分布约15个复合物。
  3. 分子模型的稳定性：通过分子动力学模拟和交联质谱数据，研究人员验证了prohibitin复合物模型的稳定性和准确性。

研究意义

  1. 科学价值：本研究首次在原子水平上揭示了人类prohibitin复合物的结构，为理解其在维持线粒体内膜完整性和空间组织中的功能提供了结构基础。
  2. 应用价值：prohibitin复合物的结构信息可能为开发针对线粒体功能障碍相关疾病（如神经退行性疾病和癌症）的治疗策略提供新的靶点。
  3. 技术突破：研究结合了冷冻电子断层扫描、亚断层图平均、分子动力学模拟和交联质谱等多种先进技术，展示了多学科交叉在结构生物学研究中的强大优势。

研究亮点

  1. 原位结构解析：研究首次在原位条件下解析了人类prohibitin复合物的结构，避免了体外纯化可能带来的结构失真。
  2. 多技术整合：研究成功整合了冷冻电镜、分子建模和交联质谱等多种技术，为复杂蛋白质复合物的结构解析提供了新的研究范式。
  3. 跨物种保守性：研究通过比较小鼠和人类的交联质谱数据，揭示了prohibitin复合物在不同物种中的结构保守性，进一步验证了其功能的重要性。

其他有价值的信息

研究还提供了关于线粒体嵴膜结构的详细数据，包括嵴膜的平均长度、间距和面积等，这些数据为未来研究线粒体结构和功能的关系提供了重要参考。此外，研究中使用的高分辨率冷冻电镜技术和分子动力学模拟方法为其他蛋白质复合物的结构解析提供了技术借鉴。