肌肉源性miR-126调控TDP-43轴突局部合成维持ALS模型神经肌肉接头完整性——《nature neuroscience》综述报道

一、学术背景与研究动机

肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种致死性的成年起病运动神经元疾病，主要特征是神经肌肉接头（Neuromuscular Junction, NMJ）功能障碍、轴突退变以及运动神经元死亡。ALS的多数病例都与TDP-43（TAR DNA-binding Protein 43，多功能DNA/RNA结合蛋白）异常密切相关，其致病机制包括TDP-43从细胞核移位到胞质并形成高磷酸化聚集体，以及对RNA剪接、转运和局部翻译调控的干扰。尤其值得关注的是，TDP-43在ALS中经常在外周轴突和NMJ处发生异常聚集，但这种聚集的诱导机制目前尚未完全阐明。

近年来的研究提示，局部蛋白合成在神经元长轴突功能和生存中尤为重要，NMJ的完整性也依赖于轴突终末的空间和时间受限的蛋白合成过程。传统观点认为ALS早期以轴突病变为主，而TDP-43在周围神经聚集可能影响NMJ的蛋白质更新和能量代谢，进而加速运动神经元的退变。与此同时，肌肉不仅被动地接受神经支配，还通过各种分子信号（尤其是外泌体中的miRNA）主动参与NMJ的维护与调控。

本研究旨在揭示TDP-43在ALS外周轴突与NMJ局部聚集的分子机制，尤其关注肌肉分泌的miRNA——miR-126a-5p——通过外泌体途径如何跨细胞调控TDP-43的局部合成，并探讨这一轴突–肌肉跨细胞沟通对ALS发病和进程的影响。

二、论文来源及作者信息

本文为原创研究论文，发表于高水平学术期刊《nature neuroscience》（volume 28, November 2025, pp. 2201–2216），DOI: https://doi.org/10.1038/s41593-025-02062-6。主要作者包括Ariel Ionescu、Lior Ankol、Anand Ganapathy Subramaniam、Topaz Altman、Iddo Magen、Yahel Cohen、Yehuda Danino等，他们均来自以色列特拉维夫大学（Tel Aviv University）、索拉斯医学中心（Sourasky Medical Center）等研究机构。

三、研究流程详述

1. 研究设计与对象

本项研究结合了临床ALS患者样本（包括SOD1基因突变体病例、散发性ALS患者以及非ALS对照）、多种ALS动物模型（尤其是SOD1^G93A和SOD1^G37R小鼠）、原代细胞共培养体系（包括人源诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和肌肉细胞）以及体外微流控芯片系统。实验流程横跨组织学分析、分子生物学、外泌体分离与鉴定、单分子荧光原位杂交（smFISH）、局部蛋白质合成检测（puromycin-PLA及O-propargyl puromycin）、基因干扰、miRNA功能验证、慢病毒过表达、AAV在体注射、行为学评估以及多组学数据分析。

2. 主要实验步骤及技术路线

(1) TDP-43在ALS患者及小鼠外周神经、NMJ局部聚集的检测

• 临床样本：通过免疫组化染色检测ALS患者（SOD1突变体与散发性ALS）的腓肠神经以及肌肉内神经，分析磷酸化TDP-43（pTDP-43）聚集体分布，与非ALS对照组比较。
• 动物模型：SOD1^G93A及SOD1^G37R小鼠外周神经与肌肉组织切片，利用免疫荧光定量pTDP-43的聚集状况。
• NMJ聚集分析：三维共定位分析TDP-43及NMJ标志物（NFH、Synaptophysin、Bungarotoxin）揭示在不同肌肉类型（快/慢疲劳肌）和疾病阶段的轴突–NMJ处TDP-43聚集。

(2) TDP-43 mRNA在轴突和NMJ的定位及局部翻译

• 微流控原代运动神经元培养体系：分离轴突与胞体RNA，定量PCR测定TDP-43及对照mRNA表达。
• 单分子荧光原位杂交（smFISH）：可视化TDP-43与β-actin mRNA在神经元轴突及肌肉NMJ内的定位。
• puromycin-PLA法：检测局部合成的TDP-43蛋白，应用于原代神经元及协同培养体系，验证肌肉对轴突局部蛋白合成的调控作用。

(3) 肌肉外泌体(EVs)及miRNA传递的分析

• 外泌体标志物免疫检测：定位CD63、CHMP2A、CD81等经典EV标志在肌肉及NMJ区域的分布。
• 外泌体功能检测：利用CD63-phluorin实时活细胞成像与CD63-GFP标记，动态追踪外泌体从肌肉到轴突的跨细胞传递过程。
• **肌肉培养液超速离心分离EVs，纳米颗粒追踪分析(NTA)、透射电子显微镜(TEM)鉴定EVs颗粒特性。
• RNA-Seq和蛋白质组学分析：研究肌肉外泌体包裹的miRNA与AGO2蛋白，揭示其携带RNA干扰复合体（RISC）影响轴突转录组和蛋白合成。
• 肌肉特异性miRNA（myomiR）富集分析：利用小RNA测序和FISH检测，分离EV内高富集miRNA（重点是miR-126a-5p）并分析其NMJ区域的表达分布。

(4) miR-126a-5p调控TDP-43 mRNA的机制验证

• 靶基因预测与验证：通过TargetScan等工具预测miR-126a-5p靶向ALS相关基因，其中TDP-43（TARDBP）在多种转录本中含有结合位点。
• 双荧光素酶报告实验：构建含有野生型和突变型TDP-43 3’UTR的报告载体，验证miR-126a-5p与TDP-43直接结合并介导翻译抑制。
• 原代运动神经元miRNA过表达与功能检测：慢病毒载体介导miR-126过表达，定量分析TDP-43转录及蛋白表达变化，验证调控效应在人源和小鼠体系中的保守性。

(5) miR-126a-5p在ALS患者、动物模型中的表达变化

• 人ALS患者血清外泌体miR-126-5p定量检测：与健康对照比较，证实ALS患者外泌体miR-126-5p显著降低。
• ALS模型动物肌肉和脊髓miR-126a-5p表达分析：发现SOD1^G93A和SOD1^G37R小鼠肌肉（尤其NMJ区域）miR-126a-5p表达下调，而脊髓表达无明显变化。

(6) 干预外泌体/miR-126a-5p分泌验证NMJ保护功能

• Rab27a条件性敲低与药物抑制：微流控芯片体系中，利用Tet-on shRNA与Rab27a或GW4869药物，在原代肌肉中敲低/抑制外泌体分泌，检测是否导致轴突TDP-43局部合成增加、NMJ蛋白合成下降、结构和功能障碍。
• miR-126a-5p特异性反义寡核苷酸（mir126i）处理：在协同培养体系中靶向抑制肌肉miR-126a-5p，观察NMJ处轴突TDP-43异常积累和退变发生。
• 双重干扰实验：同时应用miR-126i与TDP-43 siRNA，发现抑制TDP-43翻译可逆转miR-126a-5p缺失诱致的轴突退变，证明miR-126a-5p主要通过调控TDP-43介导NMJ保护。

(7) miR-126过表达改善ALS模型表型

• 体内AAV介导miR-126过表达：对SOD1^G93A小鼠中央神经系统和一侧腓肠肌注射PHP.EB AAV表达miR-126-GFP，行为学检测运动功能（如Catwalk步态分析、四肢支撑等）在疾病进展期显著改善，同时NMJ轴突TDP-43聚集减少，但长程存活无显著改变（因miR-126表达水平未完全纠正）。
• 人源iPSC-ALS模型协同培养体系：在人iPSC来源SOD1^A5V和TDP-43^M337V突变体神经元-肌肉共培养体系中慢病毒表达miR-126，证实同样能显著减少轴突处pTDP-43聚集并保护神经退变。

四、研究结果详述

TDP-43外周轴突与NMJ聚集现象

作者系统地证明TDP-43不仅在ALS患者和动物模型的脊髓细胞核异常，也在外周神经和NMJ处出现磷酸化聚集，尤其是在SOD1突变体病例中（以往认为不伴随TDP-43病理）。该聚集现象在运动功能丧失后期尤为显著，且与轴突局部蛋白合成能力下降严格相关。不同鼠种和肌肉类型对聚集现象的易感性存在差异（例如在快疲劳肌肉EDL更明显）。

TDP-43 mRNA轴突和NMJ区域定位与合成

通过微流控分离和分子检测，作者证实TDP-43 mRNA不仅定位于胞体，只要也大量而稳定地分布于轴突终末和NMJ。通过puromycin-PLA检测，实验证实TDP-43在轴突端局部翻译活跃，而原代肌肉共培养体系中局部合成被显著抑制，提示肌肉可通过分泌因子（如miRNA）参与这一调控。

肌肉外泌体介导miRNA（特别是miR-126a-5p）跨细胞调控机制

肌肉外泌体高度富集于NMJ区域，其内含有多种miRNA以及RNA干扰复合体成员AGO2，可被运动神经元轴突摄取，在细胞间物质传递和转录后调控中扮演枢纽。一系列实验揭示，miR-126a-5p在EVs中显著富集且定位于NMJ，而非肌肉胞体或其他组织，预示其专职于跨细胞调控。

miR-126a-5p对TDP-43局部合成的直接抑制作用

通过基因工程和双荧光素酶报告体系，作者明确miR-126a-5p直接结合TDP-43主轴突特异性转录本的3’UTR位点，抑制翻译并降解mRNA。这一机制在小鼠和人模型中均获得验证，表明其功能具有高跨物种保守性。

ALS条件下miR-126a-5p异常下调，促进TDP-43聚集和神经退变

无论是人ALS患者血清、ALS动物模型肌肉、还是NMJ微环境，miR-126a-5p均显著下调，直接关联于轴突局部TDP-43聚集增强和结合蛋白合成能力下降。进一步的干扰实验（敲低EV分泌、抑制miR-126a-5p）均导致NMJ功能障碍、结构退变，并证明只有抑制TDP-43合成才能防止上述表型。

miR-126a-5p过表达可缓解ALS模型表型

作者通过AAV或慢病毒介导miR-126a-5p过表达，不论是鼠源还是人源ALS模型，均可显著减少轴突pTDP-43聚集，恢复NMJ蛋白合成能力及结构功能，延缓运动功能减退，尽管未能完全改善生存率。

五、研究结论及意义

本项研究创新性地揭示了ALS中NMJ蛋白合成的跨细胞调控新机制——肌肉源性外泌体携带miR-126a-5p可直接抑制轴突TDP-43的局部合成，维持神经元末端合成与NMJ的完整性。miR-126a-5p在NMJ高富集且ALS条件下显著下调，导致抑制解除、TDP-43异常局部积累，进而诱发轴突蛋白合成障碍、线粒体功能紊乱和神经肌肉接头退变。这一机制的揭示，不仅为理解ALS的发病过程和早期病理变化提供了核心分子基础，也为未来针对轴突末端蛋白合成调控的治疗策略（如miRNA递送、外泌体工程等）提供了理论依据与技术路线。

六、研究亮点与创新

• 机制创新：首次系统阐明肌肉向轴突递送miR-126a-5p外泌体通过跨细胞方式调控局部蛋白合成，并在ALS中这一通路发生系统性损伤。
• 方法进步：巧妙结合微流控芯片、单分子荧光杂交、原位蛋白合成检测、外泌体追踪和行为学评价，为神经肌肉接头微环境信号研究提供新范式。
• 临床联结：证实人ALS患者血清外泌体miR-126a-5p显著下调，有望作为发病早期生物标志物，并指导基于外泌体miRNA的新型治疗探索。
• 横跨物种验证：小鼠、人iPSC模型结果高度一致，提升了研究结论的临床转化潜力。

七、研究展望与不足

作者也坦言当前ALS病例和样本量有限，有待更大队列验证miR-126a-5p作为普适生物标志物及介入靶点的临床意义。此外，miR-126a-5p在NMJ附近非神经元（如雪旺细胞）是否有特殊作用、外泌体定向递送及长期表达的技术瓶颈，都是未来值得深入探讨的问题。

八、总体评价与意义

该研究以多学科交叉思维切入ALS早期病理，打通了“肌肉-轴突-NMJ”信号跨界调控通路，为理解ALS的分子发病机制和精准干预措施提供了坚实基础。基于肌肉外泌体富集的miRNA在NMJ稳态中的决定性作用，为神经退行性疾病的早期检测和个性化治疗开辟了新径路。同时，本研究还提示局部蛋白合成调控不仅依赖于神经内在机制，更受外部组织（如肌肉）动态影响，拓展了运动神经元疾病系统发病的新视野。